加味丹參飲對心肌缺血再灌注損傷血瘀證兔腫瘤壞死因子α和白細胞介素-2的影響1)

李鑫輝,黃政德,葛金文

心肌缺血最有效的治療措施是恢復血液供應,缺血后恢復血流供應的過程稱為再灌注,再灌注可使缺血心肌損傷加重,即產生心肌缺血再灌注損傷(ischermic reperfusion injury,IRI)。心肌IRI的發生、發展是個多因素協同作用的過程。研究證明,炎癥在心肌IRI的發生與發展中起著關鍵作用[1],隨著再灌注的進行,大量活化的中性粒細胞聚集在心肌微血管內并浸潤到心肌組織中,通過釋放細胞炎性物質引起心肌損傷。本實驗采用血瘀證兔心肌IRI模型,觀察加味丹參飲對心肌IRI時炎癥因子及心肌酶的影響,以進一步探討其對心肌IRI保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 家兔60只,體重1.5 kg～2.5 kg,雌雄兼用。購自湖南中醫藥大學實驗動物中心。許可證號:SYXK(湘)2003-0001。

1.1.2 藥物 加味丹參飲(丹參20 g,檀香6 g,赤芍10 g,川芎6 g,當歸6 g,紅花6 g,生地12 g,黃芪20 g等),藥材由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供,浸泡、煎煮、去渣,濃縮至藥液濃度為1 g/mL,保存備用。丹參注射液(正大青春寶藥業有限公司,生產批號:國藥準字Z33020177)每支 10 mL。

1.1.3 儀器與試劑 小動物呼吸機,DW-2000型,上海嘉鵬;放射免疫計數器,ac1500r型,中國科技大學;全自動生化分析儀,CL-7200型,日本島津;血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-2(IL-2)試劑,購于北京科美東雅生物技術有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑,北京九強生物技術有限公司。

1.2.1 動物分組 家兔 60只,隨機分為 A組(空白組)、B組(血瘀證組)、C組(IRI組)、D組(預處理組)、E組(丹參組)、F組(加味丹參飲組),每組10只。空白組:于造模同期注射等量生理鹽水,同期開胸,冠脈穿線不結扎。血瘀證組:血瘀證造模結束后第2天,開胸穿線不結扎。IRI組:血瘀證造模結束后第2天,開胸結扎冠脈30 min,恢復冠脈血流90 min。預處理組:血瘀證造模結束后第2天,開胸結扎冠脈5 min,再灌注5 min,共反復3次,余同C組。丹參組和加味丹參飲組處理同C組。

1.2.2 造模方法 建立血瘀證動物模型:于兔耳緣靜脈緩慢注射去甲腎上腺素 0.1 mg/(kg?d)連續20 d,于造模 1 d靜脈注射牛血清白蛋白 250 mg/kg,間隔10 d,再注射1次,共2次,以血液流變學指標較空白組升高有差異,說明血瘀證動物模型成功。建立心肌缺血再灌注模型:血瘀證家兔用25%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉后固定,記錄標準Ⅱ導聯心電圖。氣管切開,連接動物呼吸機。開胸暴露心臟,于左心耳下左冠狀動脈前降支上1/3處穿線,在線兩段各穿1結扎環以阻斷冠脈血流。以心電圖ST段出現弓背抬高為結扎成功,以ST段下降1/2為血流再灌注成功。

1.2.3 給藥劑量與方法 給藥劑量根據成人臨床劑量,按動物體表面積換算。E組于兔耳緣靜脈給藥,在開胸前3 d開始靜注丹參注射液0.6 mL/(kg?d);F組灌胃給藥,在開胸前3 d開始灌胃加味丹參飲10mL/(kg?d)[相當于生藥含量5.16 g/(kg?d)];A、B、C、D組在開胸前3 d灌胃等量生理鹽水。

1.2.4 實驗指標測定 各組在實驗結束時頸動脈取血,血清TNF-α和IL-2測定采用放射免疫法,測定LDH和CK-MB,用島津全自動生化分析儀,由湖南中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科測定。

2 結 果

2.1 對心肌缺血再灌注損傷血瘀證兔TNF-α和IL-2水平的影響 C組TNF-α和IL-2水平均升高,與A組和B組比較差異有統計學意義(P＜0.05),E組和F組 TNF-α和IL-2水平均降低,與C組比較差異有統計學意義(P＜0.05),D組和F組比較無統計學意義。心肌IRI后血瘀證兔炎癥因子水平明顯升高,而加味丹參飲可明顯降低炎癥因子水平。詳見表1。

表1 各組兔 TNF-α和IL-2水平比較(±s)ng/mL

表1 各組兔 TNF-α和IL-2水平比較(±s)ng/mL

組別 n TNF-α IL-2 A組 10 1.21±0.67 2.56±0.51 B組 10 1.32±0.37 2.66±0.67 C組 10 2.92±0.361)2) 4.35±0.991)2)D組 10 1.96±0.381)2)3) 3.27±0.641)3)E組 10 2.44±0.371)2)3)4) 3.35±0.661)2)3)F組 10 2.30±0.251)2)3) 3.64±0.421)2)3)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05;與C組比較,3)P＜0.05;與D組比較,4)P＜0.05

2.2 對心肌缺血再灌注損傷血瘀證兔心肌酶的影響 C組LDH和CK-MB均高于A組和B組(P＜0.05);E組和F組LDH和CK-MB均較C組明顯降低(P＜0.05)。說明心肌IRI后血瘀證家兔心肌酶水平明顯升高,而加味丹參飲可明顯降低LDH和CK-MB的水平。詳見表2。

表2 各組兔心肌酶水平比較(±s)U/L

表2 各組兔心肌酶水平比較(±s)U/L

組別 n LDH CK-M B A組 10 145.38±55.11 466.75±283.95 B組 10 168.75±84.44 502.88±262.84 C組 10 418.63±123.151)2) 1 088.00±155.471)2)D組 10 262.63±76.911)2)3) 539.13±171.282)3)E組 10 289.88±188.851)2)3) 744.88±243.311)2)3)4)F組 10 244.00±103.113) 752.00±119.111)2)3)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05;與C組比較,3)P＜0.05;與D組比較,4)P＜0.05

3 討 論

隨著溶栓療法、經皮穿刺冠狀動脈腔內成形術(PTCA)、冠狀動脈旁路搭橋術等廣泛應用于臨床,心肌缺血的治療進入了再灌注時期,但在心肌得到血液再灌注后,不僅功能未得到恢復,反而使心肌損傷加重。炎癥在心肌缺血再灌注損傷的發生與發展中起著重要作用,再灌注心肌是產生炎性細胞因子的主要來源[2],炎癥損傷貫穿于心肌細胞損傷的全過程,隨著再灌注的進行,大量活化的中性粒細胞聚集在心肌微血管并浸潤到心肌組織中,通過釋放細胞炎性物質引起心肌損傷。TNF-α和IL-2是重要的炎性細胞因子,在正常的心肌組織中它們含量很低,心肌IRI后數分鐘由巨噬細胞和單核細胞等大量釋放,過量的炎性細胞因子可通過第二信使通路蛋白激酶C(PKC)和絲裂原蛋白激酶(MAPKs)使核轉錄因子κ B(NF-κ B)得以活化而轉核發揮其調控作用。NF-κ B活化能調控多種靶基因的表達,如黏附分子家族的細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)等[3],在這些黏附分子作用下,白細胞在缺血區黏附、聚集,造成內皮損傷,血栓形成。同時,這些黏附分子又促使白細胞穿內皮遷移、浸潤并損傷心肌[4]。沈波等[5]探討趨化因子受體5(CCR5)抗體對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其作用機制,結果顯示CCR5抗體可以通過抑制細胞因子 TNF-α從而阻止NF-κ B的早期活化而抑制ICAM-1表達、減少白細胞的黏附聚集從而對缺血再灌注心肌起到保護作用。陳玉東[6]探討血清 TNF-α在兔心肌缺血再灌注中的動態變化及卡托普利的干預作用,結果顯示TNF-α參與了心肌缺血再灌注的發生,卡普利在體內可能通過抑制 TNF-α的生成或釋放,發揮心肌缺血再灌注損傷的保護作用。劉愛華等[7]探討銀杏酮酯(GBE50)預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及對炎癥細胞因子和抗炎因子的影響,結論提示GBE50可能通過抑制炎性細胞因子、促進抗炎因子的表達,對心肌缺血再灌注后的炎癥反應發揮調控作用。盧向航等[8]探討延遲相嗎啡預處理對兔心肌缺血再灌注損傷的保護機制,結果顯示嗎啡預處理延遲相可通過調控炎性細胞因子平衡發揮心肌保護作用。本實驗建立血瘀證 IRI模型,觀察到IRI后 TNF-α和IL-2水平均升高,這與以往研究一致,加味丹參飲組能明顯降低TNF-α和IL-2水平,與IRI模型組比較有統計學意義(P＜0.05),與預處理組比較無統計學意義。本實驗結果表明,加味丹參飲可以抑制心肌缺血再灌注時炎性遞質激活,從而可以保護心肌 IRI。

心肌酶在正常生理狀況下廣泛存在于心肌細胞中,在心肌缺血后由于無氧代謝導致大量有害的物質如乳酸和氧自由基等在心肌中堆積,導致心肌細胞損傷,細胞膜通透性增加,使細胞內酶大量釋放入血液,因此,臨床常以血清心肌酶作為心肌損傷的重要指標。本實驗中,IRI組LDH和CK-MB水平明顯升高,而加味丹參飲能使LDH和CK-MB水平明顯下降,與IRI組比較有統計學意義(P＜0.05),加味丹參飲能有效減少心肌酶外漏,從而對心肌損傷起著保護作用。

中醫學雖然沒有心肌 IRI這一病名,但根據其病變部位(心)和臨床表現,應屬于胸痹心痛、真心痛等范疇。中醫理論認為,心肌IRI病位在心,中醫辨證多屬氣虛血瘀,本虛標實之證。石高舉等[9]探索活血化瘀類中藥在防治冠心病心絞痛中的獨特優勢,其研究結果為臨床上研究活血化瘀類中藥在冠心病發病機制中的抗炎作用提供了有力的證據。孫曉莉等[10]應用生脈注射液對心肌缺血再灌注損傷家兔進行干預治療,結果顯示生脈注射液可通過調控細胞因子,拮抗全身炎癥反應而保護心肌細胞,減輕心肌IRI。本課題在血瘀證基礎上,建立 IRI模型,應用加味丹參飲預處理,陳修圓謂:“丹參飲治療心痛、胃痛諸痛多效”。加味丹參飲主要用治于缺血性心臟病,病位在心不在胃,故去原方砂仁,加川芎、赤芍、當歸、黃芪等藥。黃芪補氣培元,扶助心氣。方中重用丹參,專入血分,內達臟腑而化瘀滯,檀香善入氣分,行氣化滯,生地、當歸扶正濡養治本。全方益氣活血,通絡止痛。其可以通過降低炎癥因子水平,防止心肌細胞損傷,至于其保護心肌IRI作用的深入機制有待進一步研究。

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