蒙古族ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1基因R219K多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性

袁托亞,王 麗,胡 剛,王悅喜,季英敏,王春燕,于賽華,海 榮

冠心病是危害人類健康的第二殺手,我國的發(fā)病率雖不及歐美各國,但也有逐年增高趨勢。研究表明,腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ABCA1)基因突變將導(dǎo)致細胞內(nèi)膽固醇外流障礙,血漿高密度脂蛋白(HDL-C)極度降低,易早發(fā)冠心病。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長度多態(tài)性方法(polymerase chain reactionrestriction fragments length polymorphism,PCR-RFLP)分析內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群和蒙古族冠心病人群中R219K多態(tài)性的發(fā)生率,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 共觀察內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族115例,其中男67例,女48例,年齡57.1歲±11.0歲。所有觀察對象之間沒有血緣關(guān)系。冠心病組60例,冠狀動脈造影確診30例(至少1支冠狀動脈直徑狹窄≥50%),根據(jù)臨床癥狀,結(jié)合心電圖、超聲心動圖、心肌灌注ECT顯像、64排冠狀動脈CT確診30例。對照組55例,經(jīng)詢問病史、體檢、實驗室檢查(血、尿、便常規(guī),血脂,血糖,肝、腎功能)、心電圖、胸片、心臟彩超、心肌灌注 ECT顯像、64排冠狀動脈CT、冠狀動脈造影等檢查排除冠心病。通過問卷訪談收集研究對象的基本資料、高血壓病病史、糖尿病病史、既往史、吸煙和飲酒史等。吸煙者的標(biāo)準(zhǔn)為每天吸煙10支以上。剔除標(biāo)準(zhǔn):風(fēng)濕性疾病、大動脈炎、梅毒、血液病、結(jié)核、腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全等。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平檢測 所有化驗檢查均采用次日清晨空腹采取靜脈血 3 mL,分離血清測定血脂水平,三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)以氧化酶法測定,低密度脂蛋白(LDL-C)用PEG變構(gòu)酶法測定,試劑均為Leadman公司生產(chǎn)。儀器為日本OLYMPUS A U 600全自動生化分析儀。

1.2.2 DNA提取 用EDTA抗凝真空采血管采集外周靜脈血3 mL,置于-80℃保存?zhèn)溆谩０凑昭骸⒓毎⒔M織基因組DNA提取試劑盒的說明提取血液DNA(由TIANGEN公司提供)。

1.2.3 設(shè)計引物 設(shè)計PCR引物,引物由Sangon公司合成,上游引物:5′GTA TTTT TGCTACCAGTTACATT TGACAA 3′,下游引物:5′GATTGGCTTCAGGATTGTTGGAA 3′。

1.2.4 ABCA1基因多態(tài)片段的PCR擴增 PCR反應(yīng)在PTC-200型循環(huán)儀中進行。PCR反應(yīng)體系50μ L,包括:2×Taq PCR MasterMix(由 TIANGEN 公司提供)25 μ L,DNA 2.0 μ L,上游和下游引物分別 1.0 μ L(10 μ M),滅菌超純水 21 μ L。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、53℃退火30 s、72℃延伸40 s,共25個循環(huán);72℃終末延伸5 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的酶切消化 酶切反應(yīng)體系30μL:PCR產(chǎn)物

10μL,XagⅠ內(nèi)切酶(由 Fermantas公司提供)1.0 μ L,10×NEB Buffer 2.0μ L,滅菌超純水 18.0 μ L,置于37 ℃酶切 12 h。取酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測并確定樣品基因型。DNA Marker為BioMarkerⅠ(由BioFluk公司提供)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組比較采用 t檢驗,兩組以上比較采用one way ANOVA檢驗。基因型和等位基因與冠心病的相關(guān)性采用比數(shù)比(odds ratio,OR)及其95%的可信區(qū)間(confidence intervals,CI)來表示。計數(shù)資料的組間比較用卡方檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 冠心病組與對照組一般資料比較 冠心病組與對照組在年齡分布上無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。常見冠心病危險因素如糖尿病史、吸煙史、男性率、HDL-C、LDL-C、TG,冠心病組明顯高于對照組(P＜0.05),冠心病組高血壓病史與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 ABCA1基因R219K位點多態(tài)性分析 用PCR-RFLP方法測定發(fā)現(xiàn),R219K擴增產(chǎn)物片段長度為177bp,經(jīng)XagⅠ酶切后,K等位基因被切為107bp和70bp兩個片段,而R等位基因由于無酶切位點仍為一個177bp的片段。這樣出現(xiàn)三種大小片段,RR型:純合子GG(177 bp);RK型:雜合子 GA型(177 bp,107 bp,70bp);KK型:純合子AA(107bp,70bp)。詳見圖1。

圖1 ABCA1基因 R219K多態(tài)性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 冠心病組與對照組等位基因片段頻率分布 在對照組中,R和K兩種等位基因片段的頻率分別為48.2%和51.8%,而在冠心病組中分別為60.0%和40.0%。對冠心病組和對照組的基因型分布進行了平衡檢驗,χ2檢驗表明兩種基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,具有群體代表性。詳見表1。

2.4 冠心病組與對照組間基因型和等位基因頻率分布比較(見表1)冠心病組KK型分布明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計算KK基因型的比數(shù)比OR值=0.411,95%CI(0.17～0.99),基因型KK個體顯著減少患冠心病的危險。詳見表1。

表1 兩組ABCA1基因型和等位基因頻率分布

3 討 論

冠心病是一種復(fù)雜的多基因疾病,多種環(huán)境因素和遺傳因素與冠心病的發(fā)病有關(guān)。臨床流行病學(xué)研究表明,遺傳因素在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,從分子遺傳學(xué)角度研究冠心病病因,可為冠心病的預(yù)防和治療提供新的途徑。

1999年人們闡明ABCA1基因變異與丹吉爾病(Tangier disease)、家族性 HDL-C缺乏的發(fā)生密切相關(guān)。ABCA1是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子(ATP binding cassette transporter,ABC)超家族的成員。人類ABCA1基因位于9q31,基因全長149kb。如果ABCA1基因突變,有可能使其編碼的氨基酸改變,從而導(dǎo)致其功能發(fā)生改變,使膽固醇外流障礙[1],膽固醇和膽固醇酯在巨噬細胞內(nèi)積聚而成為泡沫細胞,繼而浸潤血管壁,促進動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生發(fā)展。ABCA1基因是調(diào)節(jié)膽固醇和磷脂代謝平衡的關(guān)鍵途徑,在動脈壁,增加ABCA1的表達可使巨噬細胞清除自身過多的膽固醇,從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用[2]。除此之外,有研究認(rèn)為,ABCA1還參與動脈粥樣硬化斑塊進展中的程序性細胞死亡和炎癥等病理過程[3]。

ABCA1基因R219K位點多態(tài)性分析,第7外顯子第1051 bp位點鳥嘌呤(G)變成腺嘌呤(A),使翻譯的蛋白質(zhì)在219位點精氨酸(R)變成賴氨酸(K),故將其命名為 R219K多態(tài)性。目前,尚未見ABCA1基因的R219K多態(tài)性在內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群中的相關(guān)報道。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法測定發(fā)現(xiàn),在蒙古族研究對象中,ABCA1基因存在RR、RK、KK三種基因型。冠心病組RK型基因頻率和K等位基因頻率低于對照組,但未達到統(tǒng)計學(xué)意義。冠心病組KK型基因頻率明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示KK基因型是冠心病發(fā)病的一個保護因子,與文獻報道一致[4]。初步研究表明同一ABCA1基因多態(tài)性在不同人種之間分布頻率有明顯差異。Singaraja等[5]報道K等位基因攜帶率在丹麥25.9%,南亞30.3%,加拿大oji-Cree人為37.8%,因紐特人為56.1%。而日本在327名小學(xué)生中做的研究顯示,K等位基因攜帶率竟達到71%。長沙地區(qū)漢族攜帶率為43.6%[6],新疆維吾爾族人群攜帶率47.1%[7]。本研究結(jié)果為51.8%。這進一步說明不同種族人群基因多態(tài)性分布頻率差別明顯,相近種族間分布頻率也有明顯差別[8]。這種差異可能與樣本的選擇和ABCA1基因R219K多態(tài)性種族、族別以及生活飲食習(xí)慣和地域差異有關(guān)。

本結(jié)果提示,ABCAl基因R219K多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群冠心病的遺傳易感性相關(guān),其中KK基因型可能是冠心病的保護因子。這種作用是否伴有血漿HDL-C水平的顯著改變,今后尚需大樣本的進一步研究證實。

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