Tenomodulin基因轉染對NIH3T3和C3H10T1/2細胞系肌腱相關分子表達的作用

蔣永康 何晶 李潔 曹誼林 劉偉

組織工程化肌腱為修復肌腱缺損提供了良好的前景[1]。由于肌腱缺乏特異的分子標志，肌腱發育生物學的研究進展緩慢，極大地限制了組織工程化肌腱研究的進展。近來研究發現，Tenomodulin（TNMD）是肌腱相對特異的分子標志，在肌腱發育成熟中起著重要作用[2－3]。研究表明，TNMD基因敲除小鼠的肌腱細胞增殖明顯減弱，細胞密度降低；膠原纖維直徑相互之間差異增大，出現直徑明顯粗大的纖維[4]。因此，推測TNMD可能影響肌腱相關基因的表達，而目前未見此方面研究報道。本實驗通過在NIH3T3和C3H10T1/2細胞系中過表達TNMD，定量PCR檢測肌腱相關基因的表達情況，從而對TNMD在肌腱發育成熟中的作用有所了解，為組織工程肌腱的構建提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養液（Gibco公司，美國），胎牛血清（Hyclone公司，美國），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國），質粒小抽提試劑盒（Qiagen公司，德國），Fugene HD Transfection Reagent（Roche 公司，瑞士），PCR試劑盒（Takara公司，日本），定量PCR試劑盒（SYBR Green，Applied Biosystems公司，美國），倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本），定量PCR熒光探測儀（Stratagene 公司，美國）。

1.2 細胞培養

分別將液氮中凍存的NIH3T3細胞系 （本實驗室細胞庫）和C3H10T1/2細胞系（中科院上海生物化學和細胞生物學研究所丁小燕實驗室惠贈）快速復蘇，用含10%胎牛血清和100 μg/mL青、鏈霉素的DMEM培養液重懸，以1×105個細胞/皿接種于10 cm培養皿中，第二天換液去除死細胞。以后每隔2 d換液，待細胞增殖達到80%～90%融合時傳代培養。

1.3 pCAGGS空載體和pCAGGS-TNMD表達載體準備

pCAGGS-TNMD表達載體由日本京都大學再生醫科學研究所Hiraki實驗室惠贈。常規轉化DH5α大腸桿菌，過夜搖菌，質粒小抽提，酶切鑒定從而得到足夠數量的pCAGGS-TNMD表達載體。因TNMD剛好是插在pCAGGS的兩個EcoR1中間，因此pCAGGS-TNMD表達載體經EcoRⅠ酶切后瓊脂糖凝膠電泳，切取線性化的pCAGGS質粒，T4連接酶16℃過夜連接，轉化DH5α，搖菌，小抽提，酶切和電泳鑒定從而得到足夠數量的pCAGGS空載體。

1.4 細胞轉染

前一天先將上述兩種細胞系分別接種于六板孔中，確保第二天達到70%～80%的匯合度。照Fugene HD轉染試劑說明書流程，分別配好含pCAGGS空載體和pCAGGS-TNMD表達載體的Fugene HD轉染試劑，靜置15 min后，加入細胞中，置入37℃培養箱中培養。48 h后，換含有800 μg/mL G418的DMEM培養液進行篩選，每3天換液，約12 d左右，細胞絕大部分已死亡，而已轉染的細胞呈克隆生長。將存活的細胞用有限稀釋法接種于96孔板中，分別篩選出單克隆來源的pCAGGS空載體和pCAGGSTNMD表達載體轉染的NIH3T3和C3H10T1/2細胞。倒置相差顯微鏡下觀察轉染前后細胞的形態。此兩種細胞用含有400 μg/mL G418的DMEM培養液維持培養并用于后續研究。

1.5 RT-PCR和定量PCR

小鼠第一代肌腱細胞（mTP1），轉染了pCAGGS空載體 (pCAGGS)和pCAGGS-TNMD表達載體（pCAGGS-TNMD）的 NIH3T3和 C3H10T1/2細胞用Trizol處理后，常規提取RNA，逆轉錄成cDNA。分別設 計 針 對 actin、pCAGGS、TNMD、collagen Ⅰ （COLⅠ）、collagenⅥ （COLⅥ）和biglycan的引物。 利用PCR試劑盒對actin、pCAGGS、TNMD進行RT-PCR檢測，證實TNMD已成功轉染后，再利用SYBR Green熒光定量PCR系統檢測TNMD和其它基因表達情況。Actin作為內參，每個樣本重復3次，且每個基因每次3個復孔，以確保數據的可重復性和準確度。

1.6 統計學方法

定量PCR數據經內參標準化后，將pCAGGS空載體組設為1，pCAGGS-TNMD表達載體組的值為與空載體組的相對值，以平均值±標準差表示，結果用配對t檢驗進行分析，P<0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 TNMD轉染檢測

對于NIH3T3細胞系：RT-PCR檢測顯示，轉染了pCAGGS空載體的細胞不表達TNMD；而轉染了pCAGGS-TNMD表達載體的細胞表達TNMD，其強度要略高于 mTP1（圖 1A）。定量 PCR顯示，pCAGGS-TNMD表達載體轉染組要比對照pCAGGS空載體轉染組高約25 000倍（P<0.05）（圖1B）。以上結果表明，TNMD在NIH3T3細胞中已成功轉染。

對于C3H10T1/2細胞系：RT-PCR檢測顯示，轉染了pCAGGS空載體的細胞只微弱地表達TNMD；而轉染了pCAGGS-TNMD表達載體的細胞高表達TNMD，其強度明顯高于mTP1（圖1C）。同時定量PCR顯示，pCAGGS-TNMD表達載體轉染組要比對照pCAGGS空載體轉染組高約350倍 （P<0.05）（圖1D）。以上結果表明，TNMD在C3H10T1/2細胞中也已成功轉染。

2.2 細胞形態觀察

倒置相差顯微鏡對轉染前后細胞形態進行觀察，結果表明，無論是NIH3T3細胞還是C3H10T1/2細胞，轉pCAGGS空載體和TNMD過表達的細胞與原正常細胞在形態上沒有明顯改變，均呈小鼠肌腱細胞樣的長梭形排列，細胞生長正常（圖2）。

2.3 肌腱相關基因的表達檢測

對于NIH3T3細胞系：定量PCR顯示，過表達TNMD后，COLⅠ沒有明顯改變，但COLⅥ和biglycan 均顯著降低（P<0.05）（圖 3）。

對于C3H10T1/2細胞系：定量PCR顯示，過表達 TNMD后，COLⅠ和biglycan明顯升高（P<0.05），但COLⅥ沒有明顯改變（圖4）。

圖1 RT-PCR和定量PCR檢測TNMD在基因轉染NIH3T3細胞系（A，B）和C3H10T1/2細胞系（C，D）中的表達（mTP1:小鼠第一代肌腱細胞；pCAGGS：pCAGGS 空載體；pCAGGS-TNMD：pCAGGS-TNMD 表達載體；*：P<0.05）Fig.1 Expression of TNMD in NIH3T3(A,B)and C3H10T1/2 cells(C,D)after transfection by RT-PCR and Quantitative PCR(mTP1:mouse tenocytes of passage 1;pCAGGS:pCAGGS empty vector;pCAGGS-TNMD:pCAGGS-TNMD expression vector;*:P<0.05)

圖2 轉染TNMD前后NIH3T3細胞系（A-C）和C3H10T1/2細胞系（D-F）的細胞形態學觀察(倒置相差顯微鏡，40×)Fig.2 Morphology observation of NIH3T3(A-C)and C3H10T1/2 cells(D-F)after transfection(Inverted phase contrast microscope,40×)

圖3 定量PCR檢測TNMD轉染NIH3T3細胞系對肌腱相關基因表達的作用Fig.3 The expression of tenocyte related genes in NIH3T3 cells after transfection by Quantitative PCR

圖4 定量PCR檢測TNMD轉染C3H10T1/2細胞系對肌腱相關基因表達的作用Fig.4 The expression of tenocyte related genes in C3H10T1/2 cells after transfection by Quantitative PCR

3 討論

TNMD是一個由317個氨基酸組成的Ⅱ型跨膜蛋白，主要表達于致密結締組織，如肌腱和韌帶中，具有抑制血管生成的作用[5－6]。其結構與另一種具有抗血管生成的蛋白Chondromodulin-Ⅰ（ChM-Ⅰ）高度同源，而后者主要在軟骨中表達。在雞胚發育過程中，TNMD的表達與肌腱始基的形成具有高度相關性，其表達部位與scleraxis基本一致，而scleraxis是TNMD的上游，能調控后者的表達[7]。TNMD基因敲除小鼠的肌腱細胞增殖明顯減弱，細胞密度降低；膠原纖維直徑差異增大，出現明顯粗大的纖維[4]。然而，TNMD對肌腱形成的直接作用以及作用機理目前尚不明確。我們推測TNMD很可能是影響了肌腱相關基因的表達而發揮作用，因此設計本實驗進行驗證。

NIH3T3細胞系是小鼠胚胎成纖維細胞系，自身基本不表達TNMD；C3H10T1/2細胞系是小鼠間充質干細胞系，自身表達低水平的TNMD。這兩種細胞系都與肌腱細胞一樣來自中胚層，有大量研究顯示，成纖維細胞和間充質干細胞都能作為組織工程肌腱的種子細胞[8－9]，因此選用上述兩種細胞系用于過表達的細胞模型。過表達TNMD前后，NIH3T3細胞系和C3H10T1/2細胞系在形態上都沒有明顯差別。但是，在肌腱相關基因水平上，兩種細胞系的結果具有顯著差異。在NIH3T3細胞系中，COLⅥ和biglycan顯著降低，這與實驗預期相反。在C3H10T1/2細胞系中，COLⅠ和biglycan明顯升高。上述差別所產生的原因可能是：NIH3T3細胞中未檢測到有TNMD的表達，表明其生長未受到TNMD的調控，轉入TNMD后可能引起了其肌腱相關蛋白合成的紊亂。而C3H10T1/2本身表達一定的TNMD，適應了TNMD的調控，過表達TNMD后能有效地增強相關基因的表達。相關原因有待進一步研究。

COLⅠ是肌腱中表達的主要膠原分子，在肌腱的形態維持和力學性能中起主要作用。COLⅥ是肌腱中表達的小分子膠原，能與COLⅠ和decorin等細胞外基質相互作用，維持整個肌腱纖維結構的完整性[10]。COLⅥ基因突變會導致Bethlem肌病和Ullrich先天性肌萎縮病[11]。Biglycan是肌腱中表達的一類富亮氨酸的小分子蛋白多糖，能與COLⅠ相結合，對維持肌腱的膠原纖維結構的調節和穩定起重要作用。Biglycan基因敲除小鼠膠原纖維直徑變小，形態異常，肌腱力學性能降低[12]。在C3H10T1/2細胞系中，TNMD過表達能明顯上調COLⅠ和biglycan，說明TNMD確實通過調控肌腱相關基因的表達而發揮對肌腱的作用。

本實驗結果表明，過表達TNMD對NIH3T3和C3H10T1/2細胞系的形態沒有影響，但能影響肌腱相關基因的表達情況。而這種影響在肌腱的膠原合成和超微結構中的作用，以及TNMD與相關肌腱基因的相互作用機制都有待于進一步研究。

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