骨髓間充質干細胞結合藻酸鹽治療椎間盤退變的實驗研究

巢玉柳 金永 卞敏凱 張亮 蔣純志

椎間盤退變是臨床的常見病。本實驗擬將兔骨髓間充質干細胞 （Bone Mesenchymal stem cells，BMSC）結合藻酸鹽凝膠，治療兔椎間盤退變，觀察其可行性和治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料

新西蘭大白兔 （南京醫科大學動物中心），3月齡，1～1.8 Kg， 雌雄不限；DMEM 培養基 （Gibco公司）；胎牛血清（天津市北辰盛達生物制品廠）；藻酸鹽（Sigma公司）；鼠抗人Ⅱ型膠原抗體以及 Elivision plus免疫組化試劑盒（邁新公司）；硫酸軟骨素、木瓜蛋白酶（Sigma公司）；二甲基亞甲藍（Aldrich公司）。

1.2 方法

1.2.1 移植物的制備

1.2.1.1 BMSC的培養和鑒定

實驗兔以3%戊巴比妥（1 mL/Kg）耳緣靜脈麻醉，股骨抽取骨髓約3 mL，FICOLL淋巴細胞分層液密度梯度離心，取中層單細胞懸液，加入DMEM培養液，貼壁法分離、培養BMSC。接種后5 d首次換液，以后每3天換液，約2周后細胞基本鋪滿單層后傳代。倒置相差顯微鏡觀察，貼壁的BMSC細胞呈長梭形，旋渦狀排列，形成集落。

1.2.1.2 藻酸鹽凝膠制備和體外BMSC復合體構建

將藻酸鈉用三蒸水制成1.2%溶液，高溫高壓消毒備用。準備無菌100 mL氯化鈣溶液。將已備好的BMSC懸液以1×106cells/mL濃度與藻酸鈉混勻后緩慢滴入氯化鈣溶液，可形成均勻的凝膠，吸取多余氯化鈣溶液，加入DMEM培養液。2 d后換液，鏡下觀察三維支架內的細胞生長良好，切片，HE染色。

1.2.2 動物模型制備及實驗分組

1.2.2.1 動物模型制備

取15只健康新西蘭大白兔，麻醉，取腹部后外側縱行切口，經腹膜外入路鈍性分離腰肌到達椎體側方，必要時破壞橫突，暴露 L2/3、L3/4、L4/5、L5/6椎間隙，16號注射器針頭刺入椎間隙5 mm，反復穿刺10次，并抽吸髓核組織。術后一天禁食，抗炎、補液。

1.2.2.2 實驗分組

將制備的動物模型隨機分為3組：治療組、對照組和空白組，每組5只。在治療組為方便復合體植入，藻酸鹽凝膠在椎間盤內完成，將已備好的BMSC細胞懸液以1×106cells/mL細胞濃度與藻酸鈉混勻后，微量注射器向損傷的椎間隙注射30 μL，然后從原針道注射氯化鈣30 μL，在體內完成凝膠過程；對照組只注入沒有細胞的藻酸鹽凝膠；空白組在損傷椎間盤后注射生理鹽水20 μL。

1.3 觀察指標

1.3.1 腰椎MRI檢查

術前 1 d、術后 2、4、8、12 周，連續行 MRI檢查。靜脈麻醉下進行MRI檢查，采用自旋回波序列，TR：3 500 ms，TE 116 ms； 層厚 3 mm， 層間距 1 mm。Dabbs method的方法測量椎間隙高度，并測量髓核T2值，計算手術前后變化比值。

1.3.2 病理組織學及免疫組化

實驗兔術后12周取材。原切口進入，迅速游離脊柱腰段。切開椎間隙，大體觀察椎間盤組織，取材。10%福爾馬林固定24 h，脫鈣1周，沿正中矢狀面縱行切開，制成蠟塊，常規切片，厚 5 μm，HE 染色；按照Elivision plus免疫組化試劑盒說明書的方法進行免疫組化，檢測組織中Ⅱ型膠原，一抗使用鼠抗人Ⅱ型膠原單抗。免疫組化結果以細胞外間質黃染為陽性，應用Leica Q550 IW計算機圖像分析系統，定量評價呈陽性染色的細胞外間質的灰度值 （灰度分級0～255級，0級為最深，255級為最淺），測得結果為視野內棕黃色的平均灰度值 （每張切片隨機采集4個高倍視野進行測定，200×）。

1.3.3 腰椎間盤髓核蛋白多糖的測定

200 μL/mL木瓜蛋白酶（含 50 mmol/L EDTA，5 mmol/L L-半胱氨酸）消化椎間盤組織24 h。取25 μL消化液與 125 μL二甲基亞甲藍（3.04 g甘氨酸，2.37 g氯化鈉，95 mL 0.1 M鹽酸，16 mg二甲基亞甲藍）混合，紫外分光光度計測量530 nm吸光值，用硫酸軟骨素制作標準曲線。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 腰椎間盤MRI的變化

術后2周MRI檢查顯示3個組的椎間盤都出現退變表現，椎間隙狹窄，T2像上椎間盤信號減弱，（退變程度見表1，2）。 MRI檢查測量手術前后椎間盤高度變化的比值，3組的椎間盤高度均有不同程度降低，其中治療組變化最小。MRI檢查測量手術前后椎間盤T2信號變化的比值，3組的椎間盤T2值均有不同程度降低，其中治療組變化最小。3組的兔腰椎間盤手術前后5個時間點對比，發生不同程度退變，治療組的退變程度明顯輕于對照組和空白組。術后12周的3組椎間盤高度和T2值手術前后的變化比值經方差分析，P<0.05,差異有統計學意義。3組數據再行兩兩比較，治療組與對照組、治療組與空白組差異具有統計學意義（P<0.05），對照組與空白組差異沒有統計學意義（P>0.05）。

2.2 大體觀察與病理組織學結果

空白組和對照組術后12周椎間盤剖面大體觀察示退變明顯，椎體邊緣骨贅形成，纖維環結構分界不清，髓核組織萎縮纖維化，出現裂隙；治療組輕度退變，組織結構尚可分清，髓核組織結構飽滿膠凍狀。

HE染色示，空白組和對照組纖維環邊緣破裂，髓核組織被纖維軟骨樣組織代替，而且皺縮出現空隙，髓核細胞數量減少。治療組結構飽滿，髓核細胞成團排列均勻。

2.3 蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量的變化

12周時空白組椎間盤髓核蛋白多糖的含量為(4.875±0.696)mg/100 mg，對照組(5.112±0.891)mg/100 mg，治療組(6.135±0.771)mg/100 mg，空白組和對照組均明顯低于治療組（P<0.05）。治療組與對照組、治療組與空白組具有顯著差異（P<0.05），對照組與空白組差異沒有統計學意義（P>0.05）。

12周后，Ⅱ型膠原免疫組化染色示治療組椎間盤組織陽性染色強于對照組與空白組。經圖像分析儀半定量測定，空白組 （151.112±1.997），對照組（150.652±2.357），治療組（142.14 ±1.754）；治療組與對照組、治療組與空白組具有顯著差異（P<0.05），對照組與空白組差異沒有統計學意義（P>0.05）。

表1 椎間盤術前與術后高度比值變化Table The ratio change of disc height Pre-and Post-operation

表2 椎間盤術前與術后T2值變化比較Table The ratio change of T2 value pre-and post-operation

圖1 免疫組化檢測各組椎間盤II型膠原（Elivision，200×）Fig.1 Collagen type II of intervertebral disc detected by immunohistochemical （Elivision，200×）

3 討論

椎間盤退變是一個十分緩慢的過程。 Sahlman等[1]應用雜合敲除技術使小鼠表達Ⅱ型膠原的Col2a1基因失活，通過影像學、偏光顯微鏡和免疫組化等方法觀察發現，椎體終板增厚鈣化，蛋白多糖減少，繼而發生椎間盤退變。這些變化表現在MRI上，可見椎間隙狹窄，代表含水量的T2信號強度減弱。本實驗采取針刺法建立腰椎間盤退變的動物模型，術后2周MRI檢查顯示椎間盤均發生退變，椎間隙變得狹窄，T2信號減弱；術后12周大體及病理切片顯示，退變椎間盤萎縮纖維化。實驗組，移植BMSC結合藻酸鹽支架，術后12周大體觀察見組織結構飽滿，Ⅱ型膠原、蛋白多糖含量多于其他2組，說明對退變椎間盤具有修復作用。

BMSC是具有自我更新能力且在適宜微環境下具有多向分化潛能的細胞，可在體外分化培養擴增，傳代穩定，可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞等。BMSC來源廣泛，生物活性強。有研究認為，同種異基因的間充質干細胞對宿主的T細胞免疫反應有免疫抑制效應，可減輕免疫排斥[2]，使異基因間充質干細胞的臨床應用存在可能。在本實驗中，也未觀察到因移植引起明顯免疫反應和炎癥反應。已有報道將BMSC作為種子細胞可在體外向髓核細胞分化[3－4]。

Sakai等[5]將兔自體間充質干細胞植入膠原凝膠支架，培養后再植入兔髓核中，結果顯示膠原凝膠其可延緩椎間盤退變。

作為組織工程化椎間盤的支架要求具有良好的生物相容性（包括組織相容性和細胞相容性）、良好的生物降解性，并具備三維立體多孔結構和可塑性及一定的機械強度，要保證良好的材料-細胞界面。

藻酸鹽是一種彈性無水D－甘露糖醛酸的聚合體，聚合體相對分子質量為5 000～15 000。在鈣離子等二價離子存在時，通過離子交聯作用聚合成開放晶格形式的三維結構的穩定的水凝膠。因其使用方便和良好的組織相容性，在組織工程骨和軟骨的研究中被廣泛應用。Horner等[6]從小牛尾部椎間盤分別取關節軟骨、髓核、內外層纖維環，用35S標記后進行藻酸鹽、膠原凝膠及單層培養，結果顯示應用藻酸鹽底物時細胞增殖最快，單層培養最慢。

本實驗采取藻酸鹽在椎間盤內局部注射，完成凝膠過程，操作方便，顯示BMSC結合藻酸鹽凝膠支架能增加髓核中蛋白多糖的合成，具有修復腰椎間盤退變的能力，有望成為治療椎間盤退變的生物學方法。

[1]Sahlman J,Inkinen R,Hirvonen T,et al.Premature vertebral endplate ossification and mild disc degeneration in mice after inactivation of one allele belonging to the Col2a1 gene for Type II collagen[J].Spine,2001,26(23):2558-2565

[2]Krampera M,Glennie S,Dyson J,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigenspecific T cells to their cognate peptide[J].Blood,2003,101(9):3722-3729.

[3]Richardson SM,Walker RV,Parker S,et al.The Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation[J].Stem cells,2006,24(3):707-716.

[4]Richardson SM,Curran JM,Chen R,et al.The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocyte-like cells on poly-L-lactic acid(PLLA)scaffolds[J].Biomaterials,2006,27(22):4069-4078.

[5]SakaiD,MochidaJ,YamamotoY,etal.Transplantationofmesenchymal stem cells embedded in atelocollagen(R)gel to the intervertebral disc:a potential therapeutic model for disc degeneration[J].Biomaterials,2003,27(20):3531-3541.

[6]Horner HA,Roberts S,Bielby RC,et al.Cells form different regions of the intervertebral disc:effect of cultures system on matrix expression and cell phenotype[J].Spine,2002,27(10):1018-1028.