脂肪間充質干細胞參與鼠尾淋巴水腫阻塞區淋巴管再生的研究

王剛 周廣東 蔣朝華 曹衛剛

肢體淋巴水腫是淋巴循環系統最常見的疾病之一，其原因為淋巴管先天發育不良或繼發性淋巴管阻塞等。目前，淋巴水腫的治療方法包括物理治療及手術治療等，雖然有一定效果，但仍不理想。尋求有效、簡便、安全且能針對淋巴水腫的治療方法，一直是國內外淋巴醫學工作者努力的方向。

近年來，應用脂肪間充質干細胞（Adipose derived stem cells，ADSC）修復缺血損傷的研究已顯示出良好的應用前景。研究發現，ADSC在體內可以向血管內皮分化，形成血液回流的通道，從而修復缺血損傷[1]。另外，促進淋巴管再生的研究發展也很快，如VEGF-c與其受體VEGFR-3相互作用可促進受損區淋巴管再生，可減輕肢體淋巴水腫[2]。血液循環與淋巴循環具有同源性，ADSC是否可用于淋巴管修復？能否形成淋巴回流的通道？如果可行的話，因ADSC來源廣，獲取的細胞數量多，且對病人損傷小，無疑可以成為淋巴水腫的新的治療方法。

本研究通過分離提取ADSC，并植入鼠尾淋巴水腫淋巴回流阻塞區，通過微淋巴管熒光示蹤，檢測其是否可以參與淋巴管再生并促進急性淋巴水腫的消退。

1 材料與方法

1.1 主要的實驗儀器與試劑

CO2細胞培養箱（Forma，美國）；培養皿（Corning，美國）；50 mL 離心管（Falcon，美國）；低速離心機（Heraeus，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；熒光體式顯微鏡（Leica，德國）；手術顯微鏡；游標卡尺；膠原酶NB4（包含Ⅰ型膠原酶，Ⅱ型膠原酶和中性蛋白酶1，Serva公司），MesenPRO RS Medium（Gibco，美國），DMEM （HyClone，美國），胎牛血清 （SAFC Bioscience， 美國）；PBS 緩沖液；Dextran rhodamine（Eugene Oregon，美國）。

1.2 主要培養液和試劑

基礎培養液：LG－DMEM，10%胎牛血清，L-谷氨酰胺 300 μg/mL，抗壞血酸 50 μg/mL，青霉素、鏈霉素各100 U/mL。

成骨誘導液：LG-DMEM，10%胎牛血清，L-谷氨酰胺 300 μg/mL，抗壞血酸 50 μg/mL，青霉素、鏈霉素各 100 U/mL，10 mM β-磷酸甘油、10 nM 維生素D3。

1.3 ADSC的分離、培養與成骨誘導分化

將6周齡的GFP小鼠腹股溝部位的脂肪作為ADSC的來源。用氯霉素滅菌水反復沖洗脂肪，用等體積膠原酶消化 （0.075%）1.5 h。1 500 r/min離心10 min，收集底層沉淀物。將細胞震蕩混勻，細胞計數儀常規計數有核細胞數。按4×105cells／cm2細胞密度接種于培養皿內，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養。將接種細胞的培養皿置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度條件下培養。48 h后進行首次換液，PBS沖洗去除漂浮組織及血細胞，更換培養液，繼續在相同條件下培養。每隔3～4 d換液，直至細胞接近80%融合時進行傳代，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。 以（0.5～1）×l04cells／cm2細胞密度接種于新的培養皿內。再次達到80%融合繼續傳代培養，取第2代細胞用于成骨誘導，誘導2周后進行茜素紅染色。

1.4 建立鼠尾淋巴水腫模型

取15只6周齡的C57小鼠，腹腔內注射10%的水合氯醛0.1 mL。麻醉成功后，鼠尾根部用75%乙醇消毒，尾基部切開皮膚達深筋膜，環形切除寬為1 mm的皮膚，鼠尾尖部皮內注射亞甲藍0.01 mL，使切除部位的兩條深層淋巴管均顯色并將其阻斷。

1.5 將ADSC植入鼠尾淋巴水腫模型阻塞區

取第一代ADSC，0.25%胰酶消化，PBS重懸，制成細胞懸液40 μL，細胞計數約為2×106cells/mL。將細胞懸液注入到鼠尾淋巴回流阻塞區（在模型制作30 d后），分別于近心端和遠心端等量注射。每隔7 d重復注射（n＝10）。 對照組（n＝5）注射等量生理鹽水。

1.6 鼠尾直徑測量與鼠尾淋巴管熒光示蹤

在動物模型制作完成后，每隔3 d測量鼠尾直徑并記錄。在距第一次植入后30 d做尾尖皮內注射Lysine-fixable rhodamine dextran(700 KDa，Molecular Prob，紅色熒光)10 μL，注射后 10 min，用熒光體式顯微鏡觀察鼠尾淋巴回流的情況。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

原代細胞接種5 h后，開始貼壁，24～48 h內細胞形態呈小圓形，色深；48 h后細胞伸展呈成纖維細胞樣；72 h后克隆開始形成；傳代后細胞仍呈成纖維細胞樣生長（圖1-A，B）。

2.2 成骨誘導分化

ADSC在成骨誘導液中培養3周，行茜素紅染色，可見紫紅色結晶沉積（圖 1-C，D），說明 ADSC具有成骨分化能力。

2.3 鼠尾淋巴水腫模型

模型制備后3 d，鼠尾開始明顯增粗，直到術后3周，鼠尾直徑達到最大并保持穩定。30 d后，鼠尾直徑逐漸下降，至70 d時鼠尾創面恢復。實驗組與對照組經配對t檢驗，P>0.05，無顯著差異（圖2）。

2.4 鼠尾淋巴管熒光示蹤

移植后1個月，鼠尾淋巴管熒光造影顯示注射區呈綠色，迂曲的淋巴管顯示為黃色，說明移植入的細胞貼附到了淋巴回流的通道。對照組則無該現象（圖 3）。

圖1 小鼠原代ADSCs培養形態學觀察和成骨誘導檢測（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.1 Morphology observation of primary passage of mouse ADSCs and detection of osteogenic induction(Inverted phase contrast microscope,40×)

圖2 鼠尾淋巴水腫模型在60 d內的形態變化Fig.2 The morphology of the lymphedema model on mouse tail

圖3 鼠尾淋巴水腫模型阻塞區淋巴管熒光造影Fig.3 Fluorescence micro-lymphangiography of the mouse tail in the lymphedema model on mouse tail

3 討論

ADSC在缺血等低氧刺激下可以表達血管內皮細胞表型，同時具備血管內皮的部分功能[3]；也有研究發現，ADSC可以分泌內皮生長因子與肝細胞生長因子，從而促進血管內皮細胞的增殖、遷移和血管新生[4]；Cai等[5]發現，干擾ADSC分泌肝細胞生長因子，會影響其修復血管損傷的能力。鑒于淋巴循環與血液循環具有同源性，我們假設ADSC也可用于修復損傷的淋巴管。

經典的淋巴水腫動物模型有很多種，如犬后肢、兔后肢、兔耳等。我們選擇鼠尾淋巴水腫模型是因為該動物模型可復制性強、穩定性高、操作相對容易。但由于低等動物的淋巴管再生能力強，大部分種系的鼠尾淋巴水腫模型僅能夠維持20～30 d，而部分品系老鼠維持時間較久，如C57小鼠可維持60～70 d左右，選擇此種小鼠模型能更好地觀察淋巴管損傷修復的過程和各實驗因素的影響。同時，由于時間窗的存在，鼠尾模型更多的被用于觀察急性淋巴管損傷后的病理變化，如膠原、淋巴管再生、異常的皮內脂肪堆積等。本實驗中，我們利用鼠尾自身淋巴管再生的時間段，研究ADSC是否參與該再生過程。

近期有多項研究發現，VEGF-c作用于其特異性受體VEGFR-3，可以促進淋巴管再生，如將重組人VEGF-c注射入鼠尾淋巴水腫模型，發現水腫消退加快；在注射抗VEGFR-3的單克隆抗體后，VEGF-c的治療作用下降[6]。本實驗結果顯示，ADSC植入后，水腫消退速度沒有明顯加快。我們認為原因可能是：①鼠尾皮下組織致密，細胞植入后易聚集，與組織接觸面少，難以存活，故我們采用少量反復注射的方法；②實驗中發現部分C57小鼠水腫期可達70 d以上，形成慢性淋巴水腫；③細胞之間及其與機體之間的相互作用復雜，不利因素難以排除。

但我們發現，ADSC可以貼附于淋巴液回流的通道。在組織間隙，從毛細血管漏出的蛋白通過間質液體流回流入淋巴管系統。此間質液體流可攜帶與淋巴系統相關的生長因子和蛋白酶，從鼠尾遠心端流入近心端。其中，蛋白酶可以分解組織，形成不規則的、迂曲的間質液體流經過的通道，此通道可看作為前淋巴管；間質液體流所攜帶的VEGF-c所形成的梯度，可以引導淋巴內皮遷移，從而形成淋巴管，完成淋巴循環的重建[7-8]。本研究中，我們觀察到ADSC形成了這一間質液體流回流通道，但ADSC通過分化為淋巴管內皮細胞來參與修復，還是分泌相關因子促進了殘存的內皮細胞或骨髓來源的內皮祖細胞參與再生，尚需進一步研究。

[1]Planat-Benard V,Silvestre JS,Cousin B,et al.Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells[J].Circulation,2004,109(5):656-663.

[2]周劍國,胡學慶,曹衛剛,等.人血管內皮生長因子-C基因治療淋巴水腫的實驗研究[J].中華整形外科雜,2007,23(6):519-521.

[3]Hamou C,Callaghan MJ,Thangarajah H,et al.Mesenchymal stem cells can participate in ischemic neovascularization[J].Plast Reconstr Surg,2009,123(2):45-55.

[4]Nakagami H,Maeda K,Morishita R,et al.Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25(12):2542-2547.

[5]Cai L,Johnstone BH,Cook TG,et al.Suppression of hepatocyte growth factor production impairs the ability of adipose-derived stem cells to promote ischemic tissue revascularization[J].Stem Cells,2007,25(12):3234-3243.

[6]Rutkowski JM,Moya M,Johannes J,et al.Secondary lymphedema in the mouse tail:Lymphatic hyperplasia,VEGF-C upregulation,and the protective role of MMP-9[J].Microvasc Res,2006,72(3):161-171.

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[8]Rutkowski JM,Boardman KC,Swartz MA.Characterization of lymphangiogenesis in a model of adult skin regeneration[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291(3):1402-1410.