非諾貝特對糖尿病大鼠主動脈組織中Trx mRNA表達的影響

王 云，劉 謙，秦明照，任 潔，劉 琦

(首都醫科大學附屬北京同仁醫院，北京100730)

高血糖引起的氧化應激不僅增加脂質過氧化，而且增強血管炎癥反應，是加速糖尿病動脈粥樣硬化的重要因素［1］。硫氧還蛋白(Trx)作為氧化應激的一個生物標志物，可以從一個方面反應機體氧化應激水平，同時Trx上調具有抗氧化的作用［2，3］。有研究表明過氧化物酶體增生物激活受體α(PPARα)激活可使Trx表達上調，而核內易位的Trx可抑制PPARα的活性［4］，在生理條件下二者形成一個負反饋環。高血糖刺激下應用PPARα激動劑對Trx的表達影響如何，相關報道較少。2009年10月～2010年6月，本研究通過檢測Trx在糖尿病大鼠主動脈組織中的表達，應用PPARα激動劑非諾貝特進行藥物干預，觀察此藥對Trx表達的影響，探討糖尿病大鼠大動脈組織中氧化應激水平變化，藥物對抗氧化應激的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇體質量180～200 g雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(級別SPF/VAF)，飼養于標準環境，12 h光照周期，自由進食水。普通飼料喂養適應環境1周后，隨機分為對照組(C組，n=10)和實驗組，對照組予普通飼料喂養，實驗組給予高脂高糖飼料［5］(20% 糖 +2.5% 膽固醇 +10% 脂肪，67.5 %常規普通飼料)喂養4周后造模。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma-Aldrich公司);檸檬酸和檸檬酸鈉(北京化學試劑廠)，10%水合氯醛(北京同仁醫院制劑室)，非諾貝特膠囊(法國利博福尼制藥公司惠贈)，TRIzol(美國Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒(美國Promega公司)，SYBR Green PCR Master Mix(英國ABI公司)。

1.3 糖尿病大鼠模型建立 禁食12 h后，實驗組于腹腔注射STZ(45 mg/kg)行糖尿病大鼠造模。5 d后應用剪尾法取血測血糖，血糖值＞16.7 mmol/L即為造模成功［5］，納入本實驗，每周監測血糖、體質量。隨機分為糖尿病組(A組，n=10)和藥物干預組(B組，n=10)，A組給予蒸餾水灌胃，B組給予非諾貝特100 mg/(kg·d)，共灌胃8周。實驗過程中A組死亡2只，B組死亡1只。

1.4 標本采集 全部大鼠采血前均禁食不禁水3 h，稱重后應用10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，采用頸靜脈插管取血約3 ml，置于不含抗凝劑真空采血管中，靜置后離心(3 000 r/min)5 min，分離出血清。留取主動脈弓、胸主動脈組織標本于－80℃凍存。

1.5 大鼠生化指標測定 應用美國Beckman公司Unicel DxC 800型全自動生化分析儀測定血糖，血脂各項包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。

1.6 大鼠主動脈Trx mRNA表達水平檢測 每只大鼠分別取主動脈組織約100 mg(于－80℃凍存)，總RNA以TRIzol提取，逆轉錄為cDNA。應用實時定量PCR儀(英國ABI公司ABI7300)行實時定量聚合酶鏈反應(Real-Time PCR)檢測各組Trx mRNA水平。應用Primer express軟件設計引物(美國Applied Biosystem公司)，引物由北京奧科生物技術有限公司合成，Trx上游引物F:5'-TCCAATGTGGTGTTCCTTGA-3';下游引物 R:5'-ATAGAACTGGAAGGTCGGCA-3'。18s上游引物F:5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3';下游引物 R:5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'。反應參數:50℃ 2 min，1個循環;95℃ 2 min，1個循環;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，50個循環;95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，95℃ 15 s，1個循環。18s rRNA作為cDNA定量的內參。以管家基因18 s為內參，計算出每個目的基因mRNA的相對含量，該值越高，表明目的基因在該模板的表達量越高。

1.7 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件，計量資料應用±s表示。各組資料首先進行正態性分布檢驗，非正態分布的計量資料分別取In對數轉換。多組間變量比較采用單因素方差分析(ANOVA)，對ANOVA有統計學差異的變量進一步采用LSD進行兩兩組間比較。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、血糖情況比較 見表1。

表1 各組大鼠體質量、血糖情況比較

2.2 各組大鼠血脂水平比較 單因素方差分析顯示，血脂各項中各組TC、TG差異無統計學意義，P＞0.05。各組 LDL、HDL差異有統計學意義，P＜0.05。進一步行組間比較，結果見表2。

表2 各組小鼠血脂水平比較(mmol/L)

2.3 各組大鼠主動脈組織中Trx mRNA表達比較A、B、C組大鼠Trx mRNA表達水平分別為46.24、79.11、9.68，P ＜0.05。進一步行組間比較，A 組、B組Trx mRNA表達水平高于C組(P＜0.05)，B組高于A 組(P ＜0.05)。

3 討論

貝特類藥物是一類人工合成的PPARα的配體，也可以稱為PPARα的藥理性激動劑。臨床上非諾貝特主要用于治療混合性高脂血癥和高三酰甘油血癥。PPARα在肝臟和腎臟中表達量很高，同時在心肌和血管組織中也有表達。激活的PPARα可以介導載脂蛋白apoA-1表達，促進脂蛋白脂肪酶合成，并通過對一些目的基因表達的調控，使脂肪酸、TG和極低密度脂蛋白合成減少［6］。

本研究給予大鼠非諾貝特100 mg/(kg·d)干預，8周后檢測血清TC、TG、HDL及LDL水平，結果顯示TC、TG較對照組和糖尿病組無明顯減低，但可明顯降低LDL，同時升高HDL，這一結果與Ye等［7］的一致。本實驗中未能看到其降低TC、TG的作用，考慮與高脂高糖飲食抑制大鼠食欲，減少其進食量有關，在造模前實驗組動物體質量比對照組降低也證實此推論。但非諾貝特降低大鼠LDL，升高HDL的作用在本實驗中是肯定的。

已有多個臨床試驗及動物實驗證實貝特類藥物在調脂同時還可以減低心血管事件的發生［8，9］，延緩動脈粥樣硬化進程［10］。這些作用不僅與其降低血脂有關，而且與其參與目的基因表達的調控有關。研究證實，在Trx的遠端啟動子區有一段過氧化物酶激活物反應元件(PPRE)，激活的核受體PPARRXR異二聚體同這段序列發生特異性結合，進而激活Trx基因轉錄，激活 PPARα能上調 Trx的表達［4］。近期也有研究報道，在單核細胞衍生的巨噬細胞中PPARα特殊的啟動子GW647可以上調Trx基因表達。上述研究均在細胞水平上進行，迄今在體動物實驗關于PPARα對Trx表達調控的研究報道較少。本研究通過在體動物實驗觀察了非諾貝特對糖尿病大鼠主動脈組織中Trx mRNA表達的影響。結果顯示，非諾貝特可以上調Trx mRNA表達水平，與對照組和糖尿病組比較，差異均有統計學意義。

到目前為止，已發現至少有60個轉錄因子的活性受到氧化還原環境的影響。Trx通過對蛋白氧化還原狀態的調節，在體內調節多種轉錄因子的活性，如:抗氧化轉錄因子Nrf2、雌激素受體、糖皮質激素受體等轉錄活性。Trx對轉錄因子活性的調控決定了Trx對基因表達的影響。在細胞內過表達Trx能增強炎癥介質誘導的血紅素加氧酶的表達，從而起到細胞保護作用。另外應用重組Trx處理細胞也能調控某些基因的表達。Das等應用小劑量Trx即可顯著誘導SOD的表達，Kontou等［11］發現還原型Trx能上調GAPDH和IKB的mRNA水平。可以推測Trx對轉錄因子及基因表達的調控在高糖氧化應激損傷及糖尿病大血管病變中可能具有非常重要的作用。本研究觀察到非諾貝特可以上調大鼠主動脈組織中Trx mRNA表達水平，提示PPARα激動劑對心血管的保護效應是通過上調Trx的基因表達，從而影響Trx介導的一系列基因的轉錄活性，以發揮其抗氧化、抗炎、抑制炎癥因子生成的作用［12］，這也可以解釋非諾貝特具有調脂外的抗動脈粥樣硬化的作用。

本研究非諾貝特可以上調主動脈組織中Trx mRNA表達，但我們沒有觀察非諾貝特對血清Trx的影響，而且不同劑量的非諾貝特或其他PPARα激動劑是否影響血清Trx水平有待在今后的工作中進一步研究。這些推論還需要進一步的研究加以證實和探討。

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