散發性腎母細胞瘤中DNMT1基因多態性和1p、16q染色體雜合性缺失的臨床價值

白 銳，胡曉麗，李艷蕓，趙林勝，耿 鑫，張維銘

(天津醫科大學基礎醫學院，天津300070)

腎母細胞瘤(WT)是一種源于后腎胚胎組織、由間葉及上皮組織構成的惡性腫瘤，臨床伴有多種器官發育畸形，占兒科腫瘤的87%［1］。DNMT1是DNA甲基化轉移酶家族中的一個重要成員，其N端具有與DNA序列及多種蛋白如DMAP1、DNMT3a結合的特性，我們推測DNMT1蛋白在此區段的多態性可能會影響DNMT1與DMAP1、DNMT3a蛋白的結合。2010年8月～2011年10月，我們觀察了35例WT患者腎組織DNMT1基因多態性，并探討了DNMT1基因多態性及1p、16q染色體雜合缺失(LOH)與WT臨床病理特征的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇天津市兒童醫院病理科確診的散發性WT患者腎組織35份(觀察組)，男15例、女20例，年齡3個月～5歲;同期選擇該院結核性、外傷性及尸檢腎組織30份(對照組)，男17例、女13例，年齡5～14歲。所有標本未經放療、化療治療，經石蠟包埋后，參照Biomiga GelDNA Extraction Kit說明提取組織DNA。

1.2 方法

1.2.1 單核苷酸多態性(SNP)位點分析 SNP位點的選取依據 dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)，在被研究區段內選取突變率較高的rs75616428、rs16999593位點，前者基因型為 C/G，后者為T/C。引物由primer3軟件設計并由北京華大基因有限公司合成。相關參數見表1。

表1 引物序列長度及退火溫度

1.2.2 PCR擴增及產物測序 用基因擴增儀對目的片段進行擴增，反應總體系為50 μl，其中2×Taq Master Mix 25 μl，高壓滅菌超純水 21 μl，100 mmol/L 上下游引物各 1 μl，基因組 DNA 模板 2 μg。SNP目的片段及內參的PCR擴增條件為:94℃預變性5 min，94℃，退火15 s，兩SNP位點及內參的退火溫度及目的片段長度見表1，72℃延伸10 min，重復34個循環后于4℃保溫。同步實施的雙向測序由北京華大基因有限公司完成。

1.2.3 酶切反應 rs75616428及 rs16999593兩位點內切酶的選取依據NEBcutter2軟件，操作分別依照BmrⅠ及BssSⅠ內切酶(Neb，美國)說明嚴格執行。酶切產物由3%瓊脂糖凝膠電泳，其中rs75616428的G基因型的酶切產物長度為150、53 bp，rs16999593的C基因型的酶切產物長度為122、80 bp。

1.2.4 鼠抗DNMT1免疫組織化學 免疫組化采用二步法，微波熱修復，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗做陰性對照，分別計算各組高表達樣本所占的比例，評判標準依據參考文獻［2］。

1.2.5 1p、16q LOH 分析 依據 Yuan 等［3］的研究，從位于WT內1p、16q LOH高頻區域的大量微衛星灶中選取4個微衛星灶作為檢測片段，即1p:D1S1469、D1S1676;16q:D16S3050、D16S303。行PCR擴增，目的片段及內參擴增在同一模板濃度及擴增條件下進行。以聚丙烯酰胺凝膠—銀染法分析LOH結果，與對照組相比顯色程度降低50%及以上者為未LOH。

1.3 統計學方法 采用SHEsis統計軟件進行Hardy-Weinberg遺傳平衡、基因型頻率、等位基因頻率、連鎖不平衡及單倍體分析;率的比較采用χ2檢驗;連鎖不平衡檢測采用D’值和R2值分析。

2 結果

2.1 SNP檢測及易感性分析

2.1.1 PCR產物酶切電泳及測序 各位點PCR產物酶切后經3%瓊脂糖凝膠電泳分離判斷基因型，測序判斷基因型見圖1～3。

圖1 DNMT1基因rs16999593位點測序圖，箭頭示C/C純合子;圖2 DNMT1基因rs16999593位點測序圖，箭頭示C/T雜合子;圖3 DNMT1基因rs75616428位點測序圖，箭頭示C/G雜合子

2.1.2 基因型和等位基因分布比較 經SHEsis軟件分析，WT組和對照組等位基因和基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，具有群體代表性。各位點等位基因和基因型分布見表2。

2.1.3 兩位點的單倍型分析 應用SHEsis軟件進行連鎖不平衡分析，結果顯示 rs16999593和rs75616428 一般連鎖(D’=0.496，R2=0.003)，因此考慮構建這兩個位點的單倍型進行分析。結果見表3。

表2 DNMT1基因rs16999593位點的基因型和等位基因的分布［例(%)］

表3 rs16999593和rs75616428單倍型分析［例(%)］

2.2 鼠抗DNMT1免疫組織化學 免疫組化顯示除間質細胞外，DNMT1蛋白120 aa裸區段在上皮細胞、胚芽細胞及間變型WT中均有表達，與正常腎組織(36.70%)相比，WT組織中 DNMT1蛋白120 aa裸區段呈強陽性病例所占的比例(48.57%)略升高(P ＞0.05)。

2.3 1p、16q LOH結果分析 本實驗所有樣本在D16S303位點擴增產物均為120 bp。1p、16q LOH比例見表4。

表4 WT中1p、16q四檢測位點在不同分期擴增量的對比

3 討論

SNP是一種常見的等位基因突變，在人類基因組中平均每500～2 000個堿基對中就有可能存在一個多態性位點［4］。本實驗中的 rs75616428、rs16999593位點均位于DNMT1的編碼區，前者可導致H(His)-R(Arg)、后者可致 V(Val)-L(Leu)，由此翻譯生成的DNMT1一級結構可因個別氨基酸通過改變其疏水性或與其他氨基酸形成新的化學鍵來影響DNMT1的構象。本研究中，觀察組兩SNP位點均出現了變異個體，尤其是rs16999593位點的變異率明顯升高。連鎖不平衡及單倍型分析表明，rs75616428、rs16999593位點存在連鎖不平衡，但由于前者C-G變異型比率過低，不足以與rs16999593共同參與致病機制。

為進一步證明DNMT1蛋白這一多態性對此蛋白與相關蛋白如DMAP1和/或DNMT3a的影響，我們通過免疫組織化學技術檢測了此未結合區段在瘤組織與正常組織中的表達，結果未發現兩組間存在差異。DNMT1蛋白與DNMT3a形成復合物并參與細胞分化［5］，而與DMAP1蛋白形成的復合物可參與雙鏈DNA損傷的修復［6］，因而與相關蛋白結合能力的減弱有可能影響胚胎期腎臟的發育及腎臟對自身損傷后的修復能力?；贒NMT1在此區段還具有結合DNA的特性，進一步的研究應致力于DNMT1多態性對DNMT1-DNA復合物形成的影響。

腫瘤伴染色體雜合性缺失在腫瘤生成過程中具有重要作用。大片缺失的染色體片段中包含大量細胞周期調節及細胞代謝調節基因如轉移浸潤抑制蛋白1p36、消耗性腎結核病蛋白4 1p36、鈣黏蛋白16 16q22及SLC家族蛋白等，這些蛋白的表達缺失有可能影響腎臟發育及腎功能，且已有關于伴有1p/16q LOH的WT患者，其瘤組織對放化療的敏感性明顯降低［7］的報道。了解基因多態性及染色體LOH特性對制定個體化治療方案有重要意義。

綜上所述，我們認為DNMT1 rs16999593多態性可能是WT的發生危險因素之一，可作為對WT進行風險評估的一個參考指標，同時1p/16q LOH檢測可作為診斷WT的簡易方法。

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