幾種不同方法檢測抗蛔蟲抗體的建立

何光志，田維毅*，高 英，王 平，王文佳，奚 錦，俞 琦，曹 峰，黃 高，蔡 琨，韓 潔，王乾宇，劉安勝，安傳偉，查高武，張 鵬

(1貴陽中醫學院，貴陽550002;2遵義醫學院附屬醫院;3天橋鄉畜牧獸醫水產站;4烏沙鎮格里小學;5捧乍中學)

蛔蟲病呈世界性分布，已成為公共衛生問題之一［1，2］。相對其他蟲種來說，蛔蟲的免疫診斷技術研究較少，發展也較緩慢。近年研究發現，宿主感染蛔蟲后能夠引起免疫反應，所以蛔蟲感染的免疫學診斷成為可能［3～6］。2009年12月 ～2010年10月，本研究用蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原，建立了間接血凝試驗(IHA)、間接ELISA和瓊脂擴散試驗(AGP)方法檢測采自農村小學生的血清樣本，并對這方法進行敏感性比較，以探討這些方法在診斷蛔蟲感染的應用價值。

1 材料與方法

1.1 試劑 鼠抗人IgG-HRP，購自上海郎頓生物科技有限公司;TMB底物溶液，購自北京天根生物公司;其他產品購自上海華美公司;戊二醛，購自河南省華龍藥業有限公司;鞣酸，購自上海華美化工有限責任公司;胎牛血清，購自杭州四季青公司;健康綿羊全血，采自貴陽醫學院實驗動物中心;瓊脂糖，購于北京華美生物有限公司。

1.2 血清樣本 蛔蟲陽性血清、蛔蟲陰性血清和人的鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲陽性血清各10份，由貴陽中醫學院微生物及寄生蟲實驗室保存;小學生血清樣本，采自貴州5個縣農村小學生，共100份。

1.3 方法

1.3.1 蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原的制備 取新鮮的雌性蛔蟲進行解剖，在蛔蟲近陰門1/3處，用小剪刀剖開子宮，用生理鹽水洗滌數次，收集蟲卵用尼龍絹過濾，獲得純凈的蛔蟲蟲卵，將蟲卵置預冷的(－70℃)研缽內，液氮研磨至粉沫狀，然后加入適量生理鹽水，振蕩混勻，4℃冷浸過夜，然后于 4℃，10 000 r/min離心30min，取上清液即得蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原，用紫外分光光度計測定蛋白質的含量，分裝暫存于－20℃備用。

1.3.2 間接ELISA方法的建立

1.3.2.1 最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數的確定將蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原用0.05 mol/L碳酸鹽(pH9.6)稀釋成20、10、5、1、0.5、0.1 μg/ml 6 個濃度包被酶聯板，100 μl/孔，每個濃度包被1列。于37℃溫1 h后，放4℃冰箱過夜，取出用0.05%Tween-20(PBS-T)洗滌3次，5min/次，然后在每孔加入1%牛血清白蛋白(BSA)100 μl封閉液，37℃封閉1 h。然后將陽性血清和陰性血清在酶標板上1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320 倍比稀釋，分別加入酶標板中，100 μl/孔，37℃反應1 h后，洗滌3次，5min/次。用1%BSA封閉液作1∶8 000稀釋鼠抗人IgG-HRP(按說明書使用)加入酶聯板，100 μl/孔，37 ℃ 反應 1 h，用0.05%PBS-T 洗滌 3 次，5min/次，加入底物溶液(TMB)100 μl/孔，反應 15min，最后加入 100 μl 2 mol/L硫酸終止反應，用酶標儀在490 nm波長下測定OD值。同時用健康人血清作方陣滴定。選擇陽性血清與陰性血清OD490的比值(P/N)最大所對應的抗原、抗體稀釋度作為判定標準。

1.3.2.2 ELISA方法建立 將蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原以最佳包被濃度包被酶標板，100 μl/孔于37℃過夜，洗滌 3 次，每次 3min，晾干;加入 100 μl/孔封閉液，37℃溫育1 h，然后將待檢血清按最佳稀釋倍數稀釋后加入酶標板，100 μl/孔，37℃溫育1 h，洗滌3次，晾干，加入最佳工作濃度的鼠抗人IgGHRP 100 μl/孔，37 ℃ 溫育 1 h，洗滌 3 次，每次 3min，晾干，加入 TMB 底物 100 μl/孔，37 ℃ 反應 15min，最后加入100 μl 2 mol/L硫酸終止反應，用酶標儀測OD490值。

1.3.2.3 酶標二抗最佳工作濃度的確定 鼠抗人IgG-HRP 作 1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000和1∶16 000倍比稀釋，通過檢測已知陽性和陰性血清，來確定酶標二抗的最佳工作濃度。

1.3.2.4 ELISA陰陽性臨界值的確定 取5份健康人血清進行ELISA檢測。同時設陽性和陰性對照。計算健康人血清OD490的平均值(±s)和標準偏差(SD)，求出陰陽臨界限±s+3SD。

1.3.2.5 特異性試驗 用建立的ELISA方法檢測蛔蟲陽性血清、陰性血清各10份，其他寄生蟲病陽性血清(鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲)陽性血清各10份，鑒定本方法特異性。

1.3.3 IHA 方法的建立

1.3.3.1 綿羊紅細胞的醛化 經靜脈采綿羊全血，5 000 r/min 離心洗滌3 次，10min/次，以 PBS(0.01 mol/L，pH7.4)配成2.5%的細胞懸液。取9倍體積的細胞懸液與1倍體積的1%戊二醛溶液混合，在室溫下緩慢攪拌1 h，5 000 r/min離心洗滌3次，10min/次，最后用含有0.1%NaN3的PBS將綿羊紅細胞稀釋成1%的細胞懸液。

1.3.3.2 醛化紅細胞的致敏 將醛化的細胞懸液用PBS稀釋成10倍體積的細胞懸液，再與等體積制備的蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原混合，于室溫條件下攪拌2 h，離心洗滌，用含 0.1%NaN3、1%BSA 的PBS洗滌，再用含0.1%NaN3、1%BSA 的 PBS配成1%的細胞懸液，即為蛔蟲間接血凝診斷試劑。

1.3.3.3 IHA最佳工作條件的確定 取蛔蟲間接血凝診斷試劑與蛔蟲陽性血清進行IHA試驗。①采用0.01%、0.02% 和 0.04% 的致敏紅血球濃度進行IHA，確定最佳反應濃度;②在最佳反應濃度的條件下，采用4℃、20℃和37℃進行IHA，確定最佳反應溫度;③在最佳反應濃度和最佳反應溫度的條件下采用30min、45min和60min進行IHA，確定最佳反應時間。以陰性和陽性反應界限明顯作為判斷標準。

1.3.3.4 特異性試驗 采用建立的IHA檢測蛔蟲陽性血清、陰性血清各10份，其他寄生蟲病陽性血清(鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲)陽性血清各10份，鑒定本研究制備的診斷試劑的特異性。

1.3.4 AGP的建立 以1.3.1制備的蛔蟲卵可溶性抗原，采用蛔蟲陽性血清、陰性血清、鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲陽性血清各10份進行AGP，驗證重組蛋白作為抗原檢測蛔蟲抗體是否具有特異性。

1.3.5 臨床血清樣本的檢測 采用本實驗建立的間接ELISA、IHA和AGP方法對100份人血清樣本進行檢測，這些血清樣本對應糞便樣本在采血時現場進行糞檢蟲卵法確定陽性率為2.0%。

2 結果

2.1 應用間接ELISA的建立

2.1.1 蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原和血清最佳工作濃度確定 用本實驗室保持的蛔蟲陽性血清和陰性血清進行方陣滴定，重復3次，測得的平均OD490值分別見表1和表2。可見當蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原濃度為1 μg/ml、抗蛔蟲抗體為1∶160 時，陽性血清 OD490值達 0.364，而陰性血清 OD490值為 0.025，陽性孔顯色明顯，陰性孔不顯色。因此，確定抗原包被濃度為1 μg/ml和抗體1∶160倍稀釋為ELISA的最佳工作濃度。

表1 陽性血清ELISA方陣滴定結果的平均OD值

表2 陰性血清ELISA方陣滴定結果的平均OD值

2.1.2 酶標二抗最佳工作濃度的確定 蛔蟲陽性對照OD490大于1.0，在陰、陽性對照差異最大時，酶標二抗的稀釋濃度即為最佳工作濃度，由表3看出1∶8 000的稀釋為酶標二抗的最佳工作濃度。

表3 酶標二抗最佳工作濃度結果

2.1.3 臨界值的確定 采5份健康人血清用ELISA法進行了檢測，每個樣品重復1次，結果分別為 0.129、0.116、0.120、0.150、0.124，陽性對照為0.902，陰性對照為 0.015，以(0.128+3 ×0.028)為臨界值，計算出臨界值0.212。

2.1.4 特異性試驗 用本試驗建立的ELISA方法檢測10份蛔蟲陽性血清全為陽性，蛔蟲陰性血清、鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲陽性血清各10份，結果全為陰性，說明本方法具有很好的特異性。2.2 IHA檢測蛔蟲抗體的建立

2.2.1 IHA最佳工作條件的確定 取本實驗制備的蛔蟲IHA診斷試劑與已知蛔蟲陽性血清和陰性血清進行IHA試驗，經過測定，采用0.1%的致敏紅血球、20℃作用45min為IHA的最佳反應條件。

2.2.2 特異性試驗 取10份蛔蟲陽性血清，10份蛔蟲陰性血清、鉤蟲、鞭蟲和蟯蟲陽性血清各10份分別與本實驗制備的IHA診斷試劑進行特異性試驗，測定結果8份蛔蟲陽性血清全為陽性，陽性率為80.0%(8/10)，其余全為陰性。

2.3 AGP的建立及特異性試驗 取10份蛔蟲陽性血清，蛔蟲陰性血清、鞭蟲、鉤蟲和蟯蟲陽性血清各10份分別與蛔蟲蟲卵蛋白可溶性抗原進行特異性試驗，測定結果表明5份蛔蟲陽性血清，陽性率為50.0%(5/10)，其余全為陰性。

2.4 幾種方法的敏感性比較 將100份血清樣本，用本實驗建立的間接ELISA方法、IHA和AGP比較這些方法的敏感性，陽性率分別為 10.0%(10/100)、7.0%(7/100)、4.0%(4/100)，其中 AGP為陽性的血清樣本間接ELISA方法和IHA試驗檢測結果全為陽性。

3 討論

蛔蟲病的準確診斷是開展蛔蟲生物學及防治等研究的基礎性工作。相對其他蟲種來說，蛔蟲病免疫診斷技術研究較少。常常采用糞便的直接涂片法或飽和鹽水漂浮法等簡單的方法結合臨床癥狀對蛔蟲作出診斷。但由于蛔蟲具有特殊生活史，當其通過糞便檢查檢出蟲卵時，宿主往往已經被幼蟲在肝臟、肺臟器官內移行而造成了損害，而且糞便檢蟲卵法檢出率低，也容易漏檢。值得注意的是，蛔蟲在光學顯微鏡下的形態很難和其他寄生蟲蟲卵區別，所以傳統診斷方法的敏感性和特異性都很差。因此，建立一種敏感而又特異的檢測方法對控制蛔蟲病具有重要意義。

本研究用蛔蟲蟲卵可溶性蛋白作為包被抗原，建立了蛔蟲特異性抗體的間接ELISA檢測方法，對100份血清進行臨床檢測，其陽性檢出率為10.0%;將蛔蟲蟲卵可溶性蛋白標記在免疫紅血球上建立了IHA檢測蛔蟲抗體，陽性檢出率為7.0%;以重組蛋白作為抗原，建立AGP，其陽性檢出率為4.0%。實驗結果表明間接ELISA比AGP和IHA敏感性較強，因此AGP和IHA在蛔蟲病的早期在診斷中容易出現漏檢，研究結果提示間接ELISA在蛔蟲陽性血清病的早期、快速診斷具有一定的應用價值，同時也表明了蛔蟲蟲卵可溶性抗原可用于蛔蟲病的診斷和抗體檢測。

ELISA方法是一種應用免疫學技術測定標本的方法，是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進行酶免疫反應，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。由于ELISA具有敏感性高、一次性檢測樣本多、試驗時間短、易操作等特點，因此倍受青睞［7］。

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