同體非血管化游離骨移植中骨形成的實驗研究

尹祿，潘慧，韓澤民，劉寶林

自體骨移植是修復頜骨缺損的主要手段之一。在血管化和非血管化游離骨移植修復頜骨缺損的比較中，非血管化骨移植在臨床應用中有著自己的特點和一定優勢，并已成功地應用到臨床實踐中。非血管化游離移植骨塊在體內的改建問題，國內外各家的報道存在著不盡相同的觀點[1-3]。本實驗通過觀察不同離體時間點的非血管化游離骨塊植入體內后的細胞成活和成骨情況，探討非血管化游離骨塊的離體時間與植入體內后骨成活之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 天津地區成年雜種狗8只，體重18～25 kg，雌雄不限。按實驗目的分為兩組，A組為離體40 min實驗組，B組為離體120 min實驗組。全麻藥為蘇眠新Ⅱ(長春獸醫研究所)；動物實驗用手術器械。骨折固定用金屬鈦板(西安中邦鈦生物材料公司)。甲酸、多聚甲醛、PBS緩沖液、APES(3-aminopropyl-Triethoxysilane)：Sigma公司。組織學HE染色和改良Mallory染色的相關試劑。光學顯微鏡：Olympus。

1.2 實驗方法 全身麻醉下拔除狗的下頜前磨牙，縫合拔牙床牙齦黏膜，在拔牙術后1個月，牙齦黏膜可以達到組織上的愈合，在截除下頜骨分離時不易穿通口腔。取下頜骨下緣切口，在拔牙區節段性截除下頜骨長約3.0 cm的骨段。取對側包括髂前上嵴的髂骨全層骨段，長度略大于3.0 cm，去除附著于骨上的肌腱等軟組織；分別在離體40 min、120 min內植入下頜骨缺損的受植區。成型板和小鈦板固定，生理鹽水沖洗術區，嚴密縫合術區切口。

1.3 標本處理及檢測方法 A、B兩組動物均在種植體植入術后4周和8周取出原植入的髂骨塊，X線檢查骨吸收及種植體位置情況。用金剛砂片沿種植體長軸縱向剖開骨質后，觀察大體標本，比較兩組標本的差別。取材厚度為5.0 mm，4%多聚甲醛固定，蔣氏固定和脫鈣液進行組織脫鈣[4]，脫水后，石蠟包埋。石蠟切片厚8 μm，做HE和蔣氏改良Mallory法染色，觀察骨塊內細胞和新骨形成情況。

2 結果

2.1 大體觀察 骨移植術后4周，A組動物植骨塊與下頜骨缺損處兩斷端間有輕度的活動度，可見骨痂形成，接觸端成凸起狀，硬度較小，手術刀可切開；外層有較多的軟組織包繞，易出血、易剝離。B組植骨塊與下頜骨缺損處的兩斷端間未見明顯骨痂形成，外層包繞的軟組織較少。

骨移植術后8周，A組植骨塊與下頜骨缺損處已連成一體，連接處稍凹，略低于兩側的骨面，兩斷端間無動度，手術刀切不開；外層包繞的軟組織少而致密，從骨面不易剝離。B組植骨塊與下頜骨缺損處的連接處可見少量骨痂形成，手術刀可切開，植骨塊有輕度的動度，有明顯吸收；外層包繞的軟組織較多，易出血，也容易剝離。

X線檢查，A組植骨塊吸收較少，骨吸收主要集中在植骨塊的下緣，B組骨塊明顯吸收。

2.2 組織學觀察 A組在術后4周和8周，移植骨塊內均可見成活的骨細胞，骨陷窩內有細胞核，偶見多核的破骨細胞(圖1)；術后8周能見到低密度的新骨形成，有些部位還可以見到數目不等島狀軟骨和軟骨向編織骨過渡的現象(圖2)。B組術后4周和8周，移植骨塊內均未見到成活的骨細胞，骨陷窩內空虛，多核的破骨細胞常見，圖象顯示為死骨，無新骨形成現象，也沒有見到軟骨的形成(圖3)。

圖1 A組HE染色(200×)

圖2 A組改良Mallory法染色(100×)

圖3 B組HE染色(200×)

3 討論

自體非血管化游離骨移植是目前臨床上修復頜骨缺損的主要方法之一[5-6]。一百多年來，對于大塊骨缺損修復時骨塊成活及成骨能力的研究，使得自體非血管化游離移植骨的歸宿成為人們最為關注的問題。單純非血管化的游離骨移植后骨塊的組織學變化最開始被描述為“爬行替代”[1]。因此，不少人認為非血管化游離骨塊植入體內后是死骨，沒有成骨能力，只能作為新骨形成的支架。骨缺損修復過程是植入的非血管化游離骨塊逐漸被吸收，其修復的骨缺損空間則由植入床周圍組織形成的新骨替代，是“爬行替代”學說的核心理論。以往的研究對非血管化游離骨塊離體時間的因素考慮較少。

近年來臨床實踐中遇到的一些現象對該理論提出了挑戰。劉寶林等在非血管化游離骨移植同期植入種植體修復下頜骨缺損的病例中發現，離體時間與種植體的骨結合成功率有著密切聯系[7]。牙種植成功的關鍵是種植體與骨形成良好的結合，有生命活力和正常新陳代謝的骨有利于種植體形成骨結合。因此推測非血管化游離移植骨塊是否成活對同期植入種植體與骨組織能否形成結合至關重要。

Stroud等認為，在新骨形成中有3個作用：骨引導、骨誘導及提供成骨細胞[8]。

骨傳導：一方面由破骨細胞吸收壞死的植骨塊，另一方面由宿主骨床的骨外膜、骨內膜、骨髓和周圍的軟組織向壞死的植骨塊內長入血管間充質細胞、軟骨細胞、成骨細胞和骨細胞，產生軟骨和骨組織以取代壞死骨而使植骨塊愈合。因此植骨塊的主要作用是起支架作用，以利宿主骨床血管和骨系細胞的長入。從骨引導作用來看，雙端受植床有利于植骨塊的愈合及盡快完成骨的改建和重建[9]。

骨誘導指移植骨刺激周圍由宿主來的間充質細胞分化為成骨細胞，形成新骨。單純骨移植的誘導成骨發生在整個移植區。

提供成骨細胞：營養物質通過小管滲入到移植骨，可使部分成骨細胞存活一定時間。臨床上剝離骨膜時僅纖維層被剝離，由成骨細胞組成的生發層仍然附著在骨皮質表面，只要骨保持濕潤，或體外不超過2 h，成骨細胞仍可存活。骨內膜表面細胞也有一層相同的成骨細胞，可成活并形成新骨[10]。Craig在定量研究密質骨不同細胞在成骨中的作用后指出，在前4周，新骨形成主要來自移植骨細胞，而在4周后新骨形成主要來自宿主骨[11]。由此看來，移植骨內可以有部分細胞成活，并具有成骨能力。

本研究對狗下頜骨長度為3.0 cm的節段性缺損用游離非血管化髂骨修復，在游離骨塊離體40 min內植入受區，骨斷端間行堅強內固定，在體內4至8周的時間內，骨連接處先形成骨痂，表明植骨塊有骨誘導能力；以后骨痂改建形成骨性連接，移植骨塊周圍形成新骨，可能表明骨塊內有活骨細胞的存在，并有一定的骨形成能力。移植骨塊內中心部位多個島狀的軟骨細胞群推測是植骨塊內松質骨的細胞形成的，因為如果是從周圍爬行來的細胞，它們應該從植骨塊的周邊逐漸向中心形成。移植骨塊內軟骨的形成是非血管化游離骨塊移入體內成活的有力證據。

骨塊成活量的多少取決于它的營養狀況。在較短的離體時間內，骨內的各種細胞可以靠自身營養儲備和對缺氧的耐受程度來維持活力。由于每種細胞對缺氧的耐受性不同，在不同的離體時間點，骨塊內活細胞的成分不盡相同，一般來說，同一組織類型的細胞，功能狀態活躍和正處于分化狀態的幼稚細胞對缺氧的耐受性較低，功能活躍的細胞維持著組織器官的正常形態和功能，幼稚細胞是組織更新的來源，這些細胞死亡意味著組織在移植一定時間后，分化成熟的功能狀態細胞完成其使命后，慢慢被機體清除；由于沒有新生組織的替補，移植物會逐漸老化、死亡，直至完全被其他組織替代。這種現象可能是“爬行替代”理論形成的基礎。

“爬行替代”理論認為，移植骨多在1周后開始吸收，周圍的破骨細胞逐漸蠶食、破骨、吸收，清除死骨；3周時有骨改建，即新骨的形成。果真如此的話，早期的破骨細胞應該在死骨的邊緣，新骨的形成在破骨細胞的后面。我們的實驗在骨連接的界面處并沒發現大量的破骨細胞，而是炎癥細胞、成纖維細胞和內皮細胞，也有少量的破骨細胞；而在死骨內可以見到數量不少的破骨細胞，這些破骨細胞可能由骨塊內的其他有活力的細胞分化而來。這些細胞的出現提示，非血管化游離骨塊的營養狀況決定著幼稚骨細胞的分化方向：營養充足的骨塊，比較原始的細胞向成骨細胞方向分化，形成新骨并維持一定的形態以行使其相應功能；營養差的骨塊，活力差，機械強度小，不利于承擔重力，原始細胞向破骨細胞方向分化，以清除該骨，待由新骨替代。死骨的形成不完全是骨塊內細胞立即死亡，部分成熟的骨細胞可能還存在一定的活力和功能，但其老化后，沒有新的骨細胞補充，骨塊也就沒有了活力。這也是死骨在一定時間以后才能出現相應體征的原因。

非血管化游離髂骨移植的成活可能與髂骨富有松質骨成分的特性有關。①松質骨富于未分化的多潛能細胞，這些細胞在短暫離體缺血的情況下可能分泌某些促血管形成的因子，易于早期建立營養通道；②松質骨多孔隙的特點有利于周圍營養物質滲透和營養通道再通。非血管化游離骨移植時離體時間短，缺血缺氧時間短，骨塊內的細胞更可能保持活力和功能狀態。離體時間對移植骨成活狀況有著決定性的影響。

本實驗以天津地區的成年健康雜種狗為研究對象，揭示了非血管化游離骨移植時的離體時間與骨塊內細胞成活密切相關的現象。實驗設定了條件，其結果有一定的局限性，因此還需要更多種屬的動物、更長時間的實驗觀察結果來反復驗證。與非血管化游離骨移植細胞成活相關的營養通道重建問題還有待于進一步研究。

[1]Phemister DB.The fate of transplanted bone and regenarative power of its various constituents[J].Surg Gyn,1914,19:303-333.

[2]Busa R,Adani R,Castagnetti C,et al.Neovascularized bone grafts:experimental investigation[J].Micro Surg,1999,19(6):289-295.

[3]徐錦程，盧保全，黃全順，等.非血管化髂骨移植修復下頜骨缺損的臨床應用[J].解剖與臨床，2004，9(2)：102-103.

[4]楊連甲,金巖.口腔和骨科的生物活性材料[M].西安：陜西科學技術出版社，1993:62-63.

[5]Kawaguchi K,Sato J,Matsunra M,et al.Clinical study of mandibular reconstruction using vascularized and non-vascularied iliac crest[J].Int J Oral Maxillofac Surg,1997,26(suppl 1):213.

[6]趙晉龍，劉寶林，何黎升，等.非血管化髂骨移植同期種植重建下頜骨節段缺損的臨床研究[J].口腔醫學研究，2003，19(1)：71-72.

[7]劉寶林.腫瘤術后頜骨缺損的功能重建[J].中華口腔醫學雜志，2003，38(1)：9-11.

[8]Stroud SW,Fonseca RJ,Sander GW.Healing of interposition autologous bone grafts after maxillary osteotomy[J].J Oral Surg,1980,38(5):878-888.

[9]唐海闊，趙怡芳.不同骨受植床游離植骨成骨能力比較的實驗研究[J].臨床口腔醫學雜志，2005,21(5)：287-289.

[10]Springfield DS.The osteogeneic phase of regenertion of bone[J].J Bone Joint Surg,1987,69(4):593-600.

[11]Craig G.Early osteogenesis in compact bone isograft:A quantitative study of the contributions of the different graft cells[J].Calcif Tissue Int,1979,29(2):225-237.