草蓯蓉甲醇提取物(BR)對大鼠肝癌細胞功能的影響

薛 勇,顏 玉,朱德全,韓誠武,劉 紅,魯兆寧

(1.佳木斯大學生命科學學院,黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003;3.黑龍江農業職業技術學院,黑龍江佳木斯 154007)

草蓯蓉 ,拉丁名:Boschniakia rossica Fedt sch et Flerov;中文名:草蓯蓉拉丁科名:Orobanchaceae;中文科名:列當科。保護級別:2;英文名:Boschniakia;別名:蓯蓉、不老草。多年生寄生草本植物,根莖瘤狀膨大,全株近無毛。莖直立,粗壯、圓柱形 ,肉質 ,紫褐色 ,高15～ 50cm,粗 1～ 2cm,葉鱗片狀 ,通常密集于莖基部,三角形或卵狀三角形。穗狀花序長5～16cm,直徑 2～ 3cm;花多 數,暗 紫色;苞片卵形,銳尖;花萼杯狀,有不整齊的 3～ 5齒裂;花冠唇形,花筒基部膨大成囊狀,上唇直立,細長,頭盔狀,近全緣或稍 2裂,下唇極短 ,明顯 3裂;二強雄蕊,伸出花冠外;心皮2,花主明顯 ,主頭2淺裂。蒴果近球形,二瓣裂;種子微小,多數。

通過檢測草蓯蓉甲醇提取物(BR)對大鼠肝癌細胞功能的影響,以篩選出能促進大鼠肝癌細胞 GJIC功能的中藥活性成分;并進一步定量檢測篩選出的活性成分對大鼠肝癌細胞 GJIC功能的影響;在此基礎上再檢測該活性成分對大鼠肝癌細胞 HSV-倒 GCV系統旁觀者效應的影響,以了解該活性成分對 GJIC功能是否有促進作用;并進一步檢測該活性成分對大鼠肝癌細胞 Cx26和 Cx32表達的影響,以期探討該活性成分影響大鼠肝癌細胞 GJIC功能的機制,為臨床綜合治療腫瘤和拓展中藥的新用途提供實驗依據。

1 材料

1.1 細胞株

大鼠肝癌細胞株 CBRH7919購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 試劑與耗材

RPMI-1640細胞培養液為上海杰美基因醫藥科技有限公司產品;0.25%含 EDTA胰酶的消化液為上海杰美基因醫藥科技有限公司產品;胎牛血清為上海越研生物科技有限公司產品;新生牛血清為北京元亨圣馬生物技術研究所產品;青、鏈霉素溶液為北京賽馳生物科技有限公司產品;四甲基偶氮唑鹽(M TT)和二甲基亞砜(DMSO)均為上海拜力生物技術有限公司產品;培養板、培養瓶、培養皿為德國 Greiner bio-one公司產品;微孔濾膜為上海亞東核級樹脂有限公司產品;塑料凍存管為上海拜力生物科技有限公司產品。

1.3 藥物

1.3.1 草蓯蓉甲醇提取物(BR)。

1.3.2 草蓯蓉甲醇提取工藝流程。

草蓯蓉干品→ZN-08型中藥粉碎機切碎→,加甲醇浸泡過夜→用布氏濾斗過濾,共提取4次,合并→ R2003旋轉蒸發器減壓濃縮→YC-015微型實驗室噴霧干燥機→甲醇提取物(BR)。

1.4 儀器

BNA-3210型 CO2培養箱 (日本 Espec);超凈工作臺 (蘇州凈化設備廠);3169型倒置顯微鏡(重慶 COIC);Bio-Rad630酶標儀 (日本 );細胞計數板 (上海求精生化試劑儀器有限公司);ALG1104型電子天平(日本島津);CDBER SCAN 510型 pH儀 (意大利 Hanna);N EX POW ER 1000型純水器(韓國 Human Corp);YDS-30液氮器(四川省樂山市東亞機電工貿有限公司公司);XY J-801型電動離心機(江蘇省金壇市醫療儀器廠);JB-1型攪拌器(上海雷磁儀器廠新徑分廠);LRH-150B生化培養箱(廣東省醫療器械廠);BCD-215KANDZ電冰箱(青島海爾股份有限公司);Haier冰柜(青島海爾特種電冰柜有限公司);YX280B手提式不銹鋼蒸汽消毒器(上海三申醫療器械有限公司);電熱恒溫干燥箱(長沙醫療器械廠)。

2 方法

2.1 細胞復蘇及培養

迅速從液氮罐中取出含大鼠肝癌細胞凍存液的凍存管,放入盛有39℃的溫水的保溫瓶中(考慮凍存管塑料管壁透熱性的不好,在37～ 38℃溫度上再適當提高1～ 2℃ ),待凍存管內細胞凍存液完全融化后,吸取凍存液至試管中,用 RPMI-1640細胞培養液稀釋 5倍,混勻 ,以1000r/min離心5min,棄上清 ,再用 RPMI-1640細胞培養液輕輕吹打成1×105/mL細胞懸液,然后將細胞懸液吸取至細胞培養瓶中,置于37℃,5%CO2培養箱內培養[1]。

2.2 細胞消化、計數、鋪板培養及傳代培養

倒置顯微鏡觀察,待以上培養的大鼠肝癌細胞生長融合率達90%以上時,吸盡細胞培養液,用 PBS(0.01mol/L,pH 7.4)沖洗細胞 2～ 3次;滴加適量含0.25%EDTA的胰酶消化細胞,輕輕晃動細胞培養瓶,顯微鏡觀察,待細胞大部分變圓之時,吸去胰酶,加入適量 RPM I-1640細胞培養液終止消化;用吸管輕輕吹打貼壁的細胞數次,倒置顯微鏡觀察細胞大部分脫落懸浮后,將細胞懸液吸取至試管中,以1500r/min離心 5min;棄上清,加入適量 RPMI-1640細胞培養液,吹打混勻細胞;用細胞計數板計數細胞,按每孔 4×103個細胞接種到 96孔細胞培養板中,每孔加入 RPMI-l640細胞培養液至總體積200μL,置于 37℃,5%CO2培養箱內培養 24h。剩余細胞按1:5左右的比例傳代培養,供實驗繼續使用[2]。

2.3 細胞分組及藥物處理

大鼠肝癌細胞隨機分為5個組:分別為1個對照組、4個實驗組。4個實驗組加入草蓯蓉甲醇提取物,使藥物終濃度分別達到 0.25g/L、 0.5g/L、0.75g/L、 1.0g/L;對照組除加等體積的生理鹽水代替用藥外,其余步驟與用藥組完全相同。每組設3個復孔。各藥物組每孔加相應濃度的藥物,各空白對照組(0 μLM組)加入與最高濃度藥物等體積的 DMSO,加藥后每孔體積不足200μL者,加入 RPM I-1640細胞培養液至總體積 200μL。置于 37℃ ,5%CO2培養箱內培養 48h。

2.4 測定指標和方法

藥物作用前后,用倒置顯微鏡觀察各組細胞的數目和形態并攝片。加藥培養48h藥物作用前后,用倒置顯微鏡觀察各組細胞的數目和形態并攝片。加藥培養48h草蓯蓉甲醇提取物 (BR)對大鼠肝癌細胞 GJIC影響的研究后,將 96孔細胞培養板從培養箱內取出,吸棄每孔上清;每孔加入無血清RPMI-1640細胞培養液 90μL后再加入 MT T10μL,置于37℃,5%CO2培養箱內培養 4h后;每孔吸棄上清 50μL,加入DMSO10μL,將 96孔細胞培養板置于空氣浴震蕩器上震蕩10min;然后用酶標儀在570nm波長下測定每孔的吸光值(A)。實驗重復 3次[3]。

2.5 計算細胞存活率

細胞存活率(%)=T/D×100%(T:測定孔細胞的光密度平均值;D:對照孔細胞的光密度平均值)。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 MTT比色法檢測草蓯蓉甲醇提取物(BR)對大鼠肝癌細胞增殖的影響

草蓯蓉甲醇提取物(BR)對大鼠肝癌細胞株的生長有抑制作用 ,0.25g/L、 0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L草蓯蓉甲醇提取物(BR)的24h體外細胞抑制率分別達到37.71%、50.28%、64.40%、98.58%;0.25～ 1.0g/L濃度范圍內的草蓯蓉甲醇提取物(BR)在6～ 24h抑制大鼠肝癌細胞呈現出時效和量效關系 (表1)。

表1 草蓯蓉甲醇提取物(BR)對大鼠肝癌細胞的抑制率 ±s)

表1 草蓯蓉甲醇提取物(BR)對大鼠肝癌細胞的抑制率 ±s)

注:相同劑量不同時間同前一組比較,▲P(0.05)、▲▲P(0.01);相同時間不同劑量同前一組比較,*P(0.05)、**P(0.01)。

3.2 草蓯蓉甲醇提取物(BR)對大鼠肝癌細胞的形態學改變

藥物作用前,倒置顯微鏡下觀察各組細胞數目和形態未見明顯差異,藥物作用24h后,鏡下觀察可見,各組的細胞數目和形態發生變化,倒置顯微鏡形態學觀察,每隔4h用倒置顯微鏡觀察對照組和實驗組細胞的形態學變化。倒置顯微鏡下,對照組大鼠肝癌細胞散在或聚集生長,有多層生長現象,細胞大小不一,多形性,貼壁能力良好;實驗組大鼠肝癌細胞生長緩慢,呈單層生長,細胞形態變圓,胞漿內可見空泡樣改變,隨著藥物作用時間的延長細胞貼壁能力逐漸減弱,較多細胞由貼壁轉為懸浮。

4 討論

惡性腫瘤是人類三大主要死亡原因之一,嚴重危害人類健康和生命。原發性肝癌(Primary liver cancer)是人類最常見惡性腫瘤之一,全球每年約有100萬人死于肝癌,其死亡率占消化系統惡性腫瘤中第三位。每年全世界有超過25萬的新發病例 ,其中11萬 (44.7%)發生在中國,且呈逐年上升趨勢。攻克肝癌已成為醫學界一個重大的研究課題。傳統的惡性腫瘤治療方法主要是手術切除、放療及化療。這些療法對早期腫瘤可獲得滿意的療效,但對于腫瘤的轉移、再發及晚期腫瘤則療效差 ,而且毒副作用較大。中藥是一個偉大的寶庫,有待開發和利用。從中藥中開發出具有抗腫瘤作用的活性成分是當前國內外醫學研究的一個熱點。如果能從中藥活性成分中篩選出具有直接抗腫瘤作用的藥物,并研究其作用機理,對于抗腫瘤新藥的研制開發將具有重要的意義。實驗結果表明,草蓯蓉甲醇提取物(BR)對對大鼠肝癌細胞有較強的細胞毒性 ,只有在高濃度(0.75g/L和1.0g/L)時才對大鼠肝癌細胞有明顯的抑制生長和殺傷作用。

[1] 沈敬華,楊麗敏,張林娜.五種中藥提取物抗腫瘤作用的研究 [J].內蒙古醫學院學報,2005,27(4):300-302

[2] 劉靜.肉蓯蓉延緩衰老研究進展 [J].中國中醫藥信息雜志,2005,11(2):20

[3] 楚玉南,戴續紅,吳華新.草蓯蓉生物學特性初探 [J].中國林副特產,2009,3:104

[4] 樸熙緒,黃紅果,樸東明.草蓯蓉乙醇提取物對二甲基亞硝胺誘導大鼠肝纖維化的治療作用 [J].世界華人消化雜志,2005,13(18):2206