大豆莖中黃酮類化合物的提取及抗氧化作用研究

劉立新,鄭春輝,徐 成,王 雪

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

大豆(Glycine max),中國古稱菽,是一種其種子含有豐富的蛋白質(zhì)的豆科植物。大豆作為中藥和食品被廣泛地應(yīng)用,大豆的栽培遍及世界各地[1,2]。大豆中含有大量的生物活性物質(zhì) ,包括磷脂、維生素類、異黃酮、大豆皂苷等。其中大豆異黃酮的抗癌活性尤為突出。大豆異黃酮不僅對乳腺癌、前列腺癌和結(jié)、直腸癌顯著有效,而且對胃癌、肝癌和白血病及其它一些癌細(xì)胞系的生長、增殖具有抑制作用。目前,對于大豆類黃酮的研究主要集中于大豆種子,而對大豆莖黃酮的研究尚未見報道。

大豆莖為大豆的地上莖。有文獻(xiàn)報道[3],大豆莖中含有多種化學(xué)成分,如大豆皂醇、大豆素、洋芹素、β-胡蘿卜苷和黃酮等。我國大豆莖資源豐富,每年產(chǎn)量可達(dá)上億噸,由于其易燃并且熱度高,在農(nóng)村通常被用作燃料,這是一種極大的浪費(fèi)。本研究以大豆莖為原料進(jìn)行黃酮類化合物的提取,并對其抗氧化活性進(jìn)行研究。這一研究將為大豆莖進(jìn)行綜合有效地利用,并對其進(jìn)一步開發(fā)和工業(yè)生產(chǎn)提供有意義的參考價值。

1 材料、試劑、儀器

1.1 主要材料

原料:大豆莖購自佳木斯市樺南縣農(nóng)村。

試劑:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,上海生化制劑廠。三氯甲烷、碘化鉀、過氧化氫、冰乙酸、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、水楊酸等均分析純。

1.2 主要儀器

Spectrumlab54紫外可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司);FA2004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-52A(上海亞榮生化儀器廠);KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大豆莖中黃酮類化合物的提取

2.1.1 原料的預(yù)處理

黃酮通常存在于植物細(xì)胞內(nèi),而細(xì)胞膜產(chǎn)生的擴(kuò)散阻力使其浸提速率比較小。為了提高提取效率,需要對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理如干燥、粉碎等,這樣有助于細(xì)胞膜的破裂,溶劑也容易浸入細(xì)胞內(nèi)部直接溶解黃酮[4]。因此將大豆莖70℃烘干,粉碎,備用。

2.1.2 提取因素及其條件的確定

為全面考察超聲提取法的工藝參數(shù)及最佳操作條件:確定以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、固液比、超聲頻率4因素且每因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計,通過測定大豆莖中的總黃酮提取率,確定最佳的提取條件。試驗(yàn)確定的因素水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平表

2.1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[5]

精密稱取蘆丁對照品25.0mg,置100mL量瓶中,加80%乙醇溶解并加至刻度。精密吸取2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0mL分置于 50mL量瓶中,分別加5%亞硝酸鈉溶液 1.5mL,混勻,放置 6min,再加 10%硝酸鋁溶液1.5mL,混勻 ,放置 6min,加 4%NaOH溶液 20mL,加水至刻度,搖勻,放置15min。在510nm的波長處測定吸光度。以吸光度 (A)為縱坐標(biāo) ,濃度 (C)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用最小二乘法進(jìn)行線形回歸,得蘆丁溶液濃度(C)與吸光度值(A)關(guān)系曲線的回歸方程式:y= 5.5402x+ 0.0028,R2=0.9996

2.1.4 提取物中黃酮類化合物含量的測定

分別量取一定體積的待測提取液,置于50mL量瓶中,分別加5%亞硝酸鈉溶液1.5mL,混勻,放置 6min,再加10%硝酸鋁溶液1.5mL,混勻,放置 6min,加 4%NaOH溶液20mL,加水至刻度,搖勻,放置15min,用紫外分光光度計,1cm比色皿在510nm的波長處測定提取物的吸光度。

2.2 大豆莖中黃酮類化合物的抗氧化作用

2.2.1 羥基自由基的清除

用 Fenton反應(yīng)法[6]:取5支帶塞的試管,依次編號,每支試管分別加入9mmol/L FeSO41mL,9mmol/L水楊酸-乙醇溶液2mL,按試管編號各加入不同濃度的黃酮提取溶液2mL,最后加入 8.8mmol/L H2O22mL進(jìn)行反應(yīng),于37℃水浴反應(yīng)40min,在525nm處測定樣品的吸光度(AS),以蒸餾水代替黃酮溶液,同上述操作,測定吸光值(A0),以磷酸鹽緩沖液為空白。清除自由基活力 SA可用公式表示:

清除率 SA=(A0-As)/A0× 100%

2.2.2 抗自氧化作用

采用烘箱儲藏法測定提取物對豬油自氧化的抗氧化能力。豬油由市售板油在燒杯中用文火熬煉而成。稱取粗黃酮粉 0.05g、0.10g、0.20g,各用5mL 60%乙醇溶解后分別加到20.00g溫?zé)嶝i油中,攪勻,以不加黃酮粉僅在20.00g豬油中加入 5mL60%乙醇為對照樣,在65℃烘箱中強(qiáng)化保存,定時攪伴,每隔2d取樣測定豬油中的過氧化值(POV值),并以此來表示豬油的氧化速度,進(jìn)而評價大豆莖中黃酮類化合物的抗氧化活性。100%

式中:POV為樣品的過氧化值,mmol/kg;V1為試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;V2為空白試驗(yàn)消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;N為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度,mol/L;0.1269為1mg硫代硫酸鈉相當(dāng)?shù)獾目藬?shù);W為試樣的質(zhì)量,g。

3 結(jié)果

3.1 大豆莖中黃酮類化合物的最佳工藝

以表1所列因素進(jìn)行 L9(34)正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。

表2 提取黃酮類化合物正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可見 ,乙醇濃度、超聲時間、超聲頻率、固液比4個因素對黃酮提取量影響的主次順序?yàn)?固液比＞乙醇濃度＞超聲時間＞超聲頻率,大豆莖黃酮最佳的提取條件為固液體積比為 1：12,乙醇濃度60%,超聲時間 45min,超聲頻率80Hz,即 A1B2C2D2,提取率為0.819%。

3.2 大豆莖中黃酮提取物對羥自由基的清除活性

根據(jù) Fenton反應(yīng)法,加入不同濃度黃酮提取溶液在525nm處測定的吸光度結(jié)果見表3。

表3 不同濃度黃酮的吸光度

圖1 不同濃度黃酮提取物與清除率的變化關(guān)系

由圖 1可以看出 ,大豆莖總黃酮提取液對由 Fenton體系產(chǎn)生的˙OH有一定的清除作用,隨著總黃酮提取液濃度的增加,對˙OH自由基的清除能力也增強(qiáng),當(dāng)提取液濃度達(dá)到1.5%時,提取液對羥自由基的清除作用達(dá)最大。

3.3 POV值測定法

不同濃度的樣品 POV值隨時間變化情況如表4。

表4 超聲法提得的黃酮化合物對豬油的抗氧化作用

由表3可以看出,大豆莖中提取的黃酮類化合物對豬油的自氧化有明顯的抑制作用,隨添加量的增加,抗氧化能力也隨之增強(qiáng)。這主要是因?yàn)辄S酮類化合物具有多酚結(jié)構(gòu),能夠提供活潑的氫質(zhì)子與油脂氧化產(chǎn)生的自由基結(jié)合成穩(wěn)定的產(chǎn)物,從而阻斷油脂的自氧化過程。

4 結(jié)論

大豆莖黃酮最佳的提取條件為固液比1：12,乙醇濃度60%,超聲時間45min,超聲頻率80Hz;大豆莖中黃酮類化合物具有較強(qiáng)的清除自由基能力和顯著的抗豬油過氧化作用,且在一定濃度范圍內(nèi),大豆莖黃酮類化合物濃度越大,其抗氧化性越強(qiáng)。

[1] 中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒 [M].北京:科學(xué)出版社,1972,493

[2] 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生藥學(xué)教研室.中國藥用植物圖鑒 [M].上海:上海教育出版社,1960,62

[3] 杜成,林丁杏.苞大豆莖化學(xué)成分研究 [J].中草藥,2002,33(12):1071-1073

[4] 歐陽平,張高勇,康保安.類黃酮提取的基本原理、影響因素和傳統(tǒng)方法 [J].中國食品添加劑,2003,(5):54-57

[5] 鮑士旦.土壤農(nóng)化分析 [M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000,373-382,390

[6] 李貴榮.枸杞多糖的提取及其對活性氧自由基的清除作用 [J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2002,19(2):94-96