HLA-DRB1等位基因多態性與慢性乙型肝炎、肝硬化關聯性的臨床研究

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 CHB組32例，其中男22例，女10例，年齡15～50〔平均(38.5±15)〕歲，臨床診斷符合CHB防治指南的診斷標準〔1〕，并且排除有其他肝炎病毒感染者;乙型肝炎肝硬化組36例，男19例，女17例，年齡20～70〔平均(40±12)〕歲。均有乙肝病史，均經肝穿活檢確診;ASC組34例，其中男18例，女16例，年齡20～60〔平均(38±12)〕歲;健康對照組39例，其中男20名，女19名，年齡20～45〔平均(30.5±10)〕歲。CHB組、肝硬化組、ASC組、健康對照組在性別與年齡方面無顯著差異，具有可比性。同時根據HBV-DNA定量檢測結果，將其中的102例HBV感染者分為HBV-DNA陽性組(≥1×103拷貝/ml)和HBV-DNA陰性組(＜1×103拷貝/ml)，比較兩組間HLA-DRB1各等位基因的頻率差異。

1.1.2 主要儀器與試劑 HERMILE E383K型高速臺式低溫離心機(德國)、HYBAID PCR儀(英國)、BDME20微型電泳儀(中國);DNA提取試劑由AXYGEN BIOSCIENCE(原杭州維特浩生化技術服務有限公司)提供;Marker(DL2000)、dNTP、Taq酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;引物由上海(生工)生物工程技術服務有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及處理分別取患者和健康對照者外周肘靜脈血5 ml，2 ml注入依地酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝管中，抗凝血顛倒混勻以備提取DNA;3 ml注入普通試管，自凝血立即以10 000 r/min離心5 min，離心后取血清測HBV-DNA載量。

1.2.2 HBV-DNA測定取患者血清樣本以及試劑盒中的對照品100μl，分別加入0.5 ml離心管中;依次加入不同的DNA提取液提取DNA，具體操作步驟按說明書進行(試劑盒購自深圳匹基公司，引物由該公司設計并合成)，定量PCR分析儀(美國羅氏公司)擴增測定DNA含量。

1.2.3 外周血單個核細胞DNA提取采用全血DNA抽提純化試劑盒(AXYGEN SCIENCE)。嚴格按照試劑說明書進行操作。基本過程:紅細胞被裂解后，被保留的白細胞經過清洗劑及蛋白酶的處理，將DNA從核中釋放出來。然后，用蛋白清除劑清除沉淀蛋白及RNA。最后，用乙醇沉淀DNA。DNA提取后用紫外分光光度計檢測DNA含量，A260/A280為1.65～2.0。DNA置－20℃冰箱保存。

1.2.4 PCR擴增根據參考文獻〔2〕設計出擴增DRB1片段的通用引物6對，選用人生長激素(hGH)基因片段作為內對照，引物序列及擴增長度見表1，所有引物均由上海生工生物工程技術公司合成。采用PCR-SSP方法進行DRB1等位基因的擴增，PCR反應條件:94℃預變性3 min;循環參數為94℃變性45 s，65℃退火45 s，72℃延伸 60 s，循環 30 次;最后 72℃再延伸5 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外燈下觀察HLA-DRB1等位基因表達情況。

1.3 統計學分析用直接計數法計算等位基因頻率。各組間等位基因的比較、兩組間等位基因分布的差異采用χ2檢驗，應用SPSS17.0統計軟件進行分析，計算χ2值及P值。

表1 PCR擴增引物序列及擴增長度

2 結果

2.1 HLA-DRB1基因PCR-SSP產物瓊脂糖凝膠電泳分析見圖1。

圖1 HLA-DRB1基因PCR-SSP產物瓊脂糖電泳結果

2.2 HLA-DRB1等位基因在各組間分布情況比較見表2，表3。CHB組HLA-DRB1*0701基因頻率為10.94%，健康對照組頻率為1.28%，差異具有統計學意義(P＜0.05)。HLADRB1*0701在肝硬化組基因頻率為12.50%，明顯高于健康對照組，差異具有統計學意義(χ2=5.88，P＜0.05)。健康對照組與ASC組基因頻率較高的位點為HLA-DRB1*0301/04(15.38%)，但與CHB組、肝硬化組相比較差異無顯著性。其他等位基因頻率其他三組與對照組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。HLA-DRB1等位基因頻率在HBV-DNA陽性組與陰性組無顯著性差異。

表2 CHB組、ASC組、肝硬化組和健康對照組HLA-DRB1等位基因分布情況〔n(%)〕

表3 HBV-DNA陽性組與HBV-DNA陰性組HLA-DRB1等位基因分布比較〔n(%)〕

3 討論

HLA-Ⅱ類分子主要表達在某些免疫細胞表面，作為輔助性T細胞CD4+的識別標志之一，參與外源性抗原的遞呈。HLA的晶體結構研究表明:Ⅱ類α鏈和β鏈的遠膜區有一個抗原結合槽，與疾病相關的關鍵性氨基酸分布其中，序列氨基酸的排列順序是由每個等位基因編碼的，由于HLA-Ⅱ類分子等位基因的多態性，導致了抗原結合槽的構象、結合及遞呈抗原肽遞呈T細胞的效率不同;HLA-Ⅱ類分子呈遞外源性抗原肽給予CD4+T細胞，促使其活化，分化為效應細胞(Th細胞)，分泌不同的細胞因子，發揮不同的免疫效應，影響疾病的轉歸。有研究表明CHB患者存在一定的免疫功能紊亂現象，主要表現為T細胞數量失衡和活化異常〔3〕。

有關HLA-DRB1等位基因多態性與疾病關系報道很多〔4～6〕，本研究以吉林地區漢族人群為研究對象，探討HLADRB1等位基因多態性與CHB、肝硬化及HBV復制狀態的相關性，結果表明，在吉林地區漢族人群中HLA-DRB1*0701等位基因型與CHB相關，可能是CHB易感基因或連鎖基因，與錢毅等〔7，8〕的研究結果一致，但與韓瑜〔9〕等的結果不同，可能與樣本量、地域等因素有關。HBV導致肝細胞損害具體機制尚不十分明確，本文研究未發現HLA-DRB1等位基因頻率與HBV的復制狀態存在關聯。

1 中華醫學會肝病學分會、感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南〔J〕.中華肝臟病雜志，2005;13(12):881-91.

2 Olerup O，Aldcner A，Fogdell A，et al.HLA-DQB1 and-DQA1 typing by PCR amplification with sequence-specific primers(PCR-SSP)in 2 hours〔J〕.Tissue Antigens，1993;41(3):119-34.

3 劉春華，崔速南，劉靚雯，等.慢性乙型肝炎肝硬化淋巴細胞亞群及HLA-DR抗原的表達〔J〕.中國現代醫學雜志，2010;20(12):1825-8.

4 楊磊，王麗君，時廣利，等.HLA-A、HLA-B、DRB1等位基因多態性與中國北方漢族肺癌患者遺傳易感相關性的研究〔J〕.免疫學雜志，2010:26(7):612-9.

5 黃曉暉，陳思東.HLA-DRBI*0701基因與吸煙在乙肝疫苗免疫應答中的交互作用〔J〕.公共衛生與預防醫學，2009;20(2):7-10.

6 潘煥峰，李東復，孫天虹，等.原發性肝細胞癌與HLA-DRB1基因多態性及DR抗原表達的關系〔J〕.中華肝膽外科雜志，2009;15(5):357-61.

7 錢毅，章廉，梁雪梅，等.廣東漢族人群乙肝疫苗免疫應答水平與HLA-DRB1*02，07，09 的相關性〔J〕. 第一軍醫大學學報，2002;22(1):67-9.

8 袁俊華，孫成剛.山東地區慢乙肝的預后與HLA-DRB1等位基因相關性研究〔J〕.臨床肝膽病雜志，2004;20(4):236-7.

9 韓瑜，馬寧，焦立新.HLA-DRBI等位基因與吉林地區漢族人群慢性乙型病毒性肝炎的關聯性分析〔J〕.吉林大學學報醫學版，2010;36(4):741-4.