胰淀素對肥胖相關性腎病大鼠的致病作用

滕春燕 盧延軍 崔英春 劉樹軍 張冬梅

(吉林大學第二醫院化驗科，吉林 長春 130041)

現在認為肥胖相關性腎病(Obesity-related glomerulopathy，ORG)的發生是體內存在胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)的直接后果。已經證明，由糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)患者體內IR所致的高胰島素血癥和高胰淀素(Amylin)血癥，可以導致Amylin在腎小球和腎間質的沉積，而成為腎小球結節樣病變以及間質性損傷的病因之一。此外，Amylin還可以誘導系膜細胞凋亡，通過誘導細胞凋亡加重局部組織損傷和纖維化的形成。ORG也伴有IR，也會出現高胰島素血癥和高Amylin血癥，但是否可以導致Amylin在腎小球的沉積、誘發腎臟損傷，目前尚未見相關報道。本實驗擬通過觀察ORG血液及腎臟病理學變化特征，探討Amylin在ORG中的致病作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 注射用大鼠 Amylin(Sigma公司);大鼠Amylin-ELISA檢測試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司);兔抗大鼠Amylin單克隆抗體、生物素化羊抗兔IgG及免疫組化試劑盒(Sigma公司)。

1.1.2 實驗動物 清潔級成年雄性Wistar大鼠40只，體重(200±20)g，由吉林大學白求恩醫學部實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作及分組 大鼠適應性喂養3 d，隨機分為三組:正常對照組(NC組，n=10)、ORG組(n=10)和Amylin皮下注射組(Amylin組，n=10)。根據文獻建立ORG大鼠模型〔1〕，ORG組和Amylin組大鼠給予高脂飼料(三大營養素所占比例:脂肪49%，蛋白質21%，碳水化合物30%;具體組成:普通飼料59%，熟豬油20%，雞蛋黃10%，蔗糖9.5%和食鹽1.5%，熱卡21 kJ/g)，NC組給予普通飼料，自由攝食，自由飲水。ORG組和Amylin組大鼠在飼養8 w后用尿蛋白試紙檢測尿蛋白，出現尿蛋白即為ORG模型成功。ORG模型成功后，Amylin組大鼠給予大鼠Amylin皮下注射(100 μg/kg)〔2〕，隔日1次，持續8 w。NC組和ORG組大鼠給予同等劑量的生理鹽水皮下注射。

1.2.2 標本采集 實驗共經歷24 w，大鼠處死前代謝籠留取24 h尿，檢測24 h尿蛋白定量(24 h-PRO)。乙醚麻醉下稱體重，測量體長即鼻至肛門的長度。心臟取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，－70℃保存。迅速開腹取出左腎，去掉被膜，經腎門冠狀面取腎組織，置于新配制的10%中性緩沖甲醛液固定，用于光鏡觀察及免疫組化檢測。

1.2.3 各項指標的檢測 (1)Lee's指數的計算:Lee's指數=〔體重(g)〕1/3×103/體長(cm)。(2)24 h-PRO檢測:考斯亮藍方法檢測。(3)血清學指標檢測:采用ELISA法檢測血清Amylin水平;放射免疫法檢測胰島素水平;自動生化分析儀測定血糖(SG)、血脂。(4)胰島素抵抗指數(HOMA-IR)計算公式:空腹血糖×空腹胰島素水平/22.5。(5)免疫組化親合素-生物素復合物(ABC)法:腎組織切片3μm，常規脫蠟至水，加入兔抗大鼠Amylin單克隆抗體(1∶100稀釋)，再加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶100稀釋)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染細胞核，封片觀察。

1.3 統計學分析 應用SPSS14.0統計軟件，數據以x±s表示，采用方差分析。兩組以上比較采用one way ANOVA檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀態 4 w內NC組大鼠進食和飲水情況、精神狀態以及活動狀況均正常;ORG組和Amylin組大鼠進食量減少，飲水明顯增加，行動遲緩，活動量減少。6 w后ORG組和Amylin組大鼠進食量逐漸增加，飲水仍然較多，毛發色澤鮮亮，精神狀態良好，活動增加;實驗結束時，ORG和Amylin組大鼠飲水和尿量均明顯增多，毛發光亮度減退，活動減少，精神出現不同程度的萎靡。

2.2 各組大鼠Lee's指數 分組時(0 w)各組大鼠Lee's指數比較無統計學差異，飼養至24 w實驗結束時，ORG組和Amylin組Lee's指數顯著高于NC組(P＜0.01)，ORG組和Amylin組兩組間無顯著差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠Lee's指數值(x±s)

2.3 各組大鼠 SG、血脂、HOMA-IR、Amylin水平及24 h-PRO的變化 與NC組比較，ORG組和Amylin組大鼠的SG、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、HOMA-IR和24 h-PRO均增高，其中ORG組的TC和24 h-PRO差異具有顯著性(P＜0.05)，Amylin組除血糖外，其余各指標差異均具有顯著性(P＜0.01)，但兩組血糖雖升高，均在正常范圍內且差異無顯著性。與ORG組比較，Amylin組除SG和HOMA-IR外，其余各指標差異均具有顯著性(P＜0.01)。見表2。

2.4 各組大鼠腎小球形態學變化 見圖1。光鏡下，ORG組和Amylin組可見腎小球體積增大，Amylin組包曼氏囊腔增寬，兩組腎小球可見節段性系膜細胞增生和系膜基質增多，部分腎小球球旁器肥大，較NC組變化明顯。

表2 各組大鼠SG、血脂、HOMA-IR、Amylin水平及24小時尿蛋白定量的變化(x±s)

圖1 各組大鼠腎小球形態學變化(PAS染色，×400)

2.5 各組大鼠腎小球免疫組化結果 NC組大鼠無Amylin表達，ORG組和Amylin組大鼠腎小球增寬的系膜區有表達，Amylin組表達量較多。見圖2。

圖2 Amylin在各組大鼠腎臟中的表達(ABC法，×400)

3 討論

肥胖在全世界呈流行趨勢，使其已經與艾滋病、吸毒和酗酒并列為世界四大生活難題，被公認為困擾人類健康的重要頑癥之一。已有研究證實肥胖可以引起腎損害，并命名為ORG。2002年6月我國首次報告ORG后〔3〕越來越多的研究者開始關注ORG，目前ORG尚無統一診斷標準〔4〕。研究表明IR、脂質代謝紊亂(高脂血癥)、腎臟血流動力學改變(腎臟高濾過、高灌注)、腎素血管緊張素系統(RAS)活化及交感神經系統(SNS)激活等是ORG的主要發病機制，其中IR在ORG的發病過程中起了重要的作用。IR狀態可影響多個臟器，包括骨骼肌、肝臟、脂肪細胞、血管平滑肌細胞、內皮細胞。胰島素能擴張入球小動脈引起腎小球高內壓、高灌注及高濾過;通過刺激胰島素樣生長因子(IGF)合成，引起腎小球肥大;通過上調轉化生長因子(TGF-β)的表達促進腎小球硬化。高胰島素亦可以直接作用于腎臟促進鈉潴留。胰島素還能直接通過增加腎小管對尿酸的重吸收，導致高尿酸血癥，加重腎臟損傷〔5〕。

本研究發現，ORG組大鼠Lee's指數在第8周開始顯著增加，直至24 w實驗結束，生化指標中TC和24 h-PRO明顯增加，余生化指標僅輕度增加，差異無顯著性，免疫組化觀察少許Amylin在增寬的系膜區表達;而Amylin組大鼠除血糖外其余各項指標均顯著增加，免疫組化可見大量Amylin在增寬的系膜區表達。由此推測，Amylin是病情發生過程中產生的一種蛋白因子，其本身可促進病情加重，隨著病情加重進一步產生Amylin，即Amylin與ORG互為因果，相互促進。Amylin是一種纖維樣多肽，與胰島素共同儲存在胰島細胞的分泌顆粒中，當Amylin表達、分泌異常時，可形成胰島淀粉樣蛋白，沉積在胰島細胞內及其周圍，對胰島β細胞有細胞毒性作用，使胰島β細胞團及胰島素分泌減少，導致β細胞功能障礙和部分胰島β細胞的喪失〔6，7〕，進而參與IR及糖尿病相關組織器官損傷。本文預實驗時統計結果發現，Amylin組大鼠SG呈上升趨勢，已有2只大鼠SG接近糖尿病大鼠模型的血糖標準(16.7 mmol/L)，其可能是肥胖易發生糖尿病的致病因素之一。同時，免疫組化結果觀察到Amylin在模型大鼠腎臟增寬的系膜區沉積，與龔偉等研究結果一致〔8〕。

綜上所述，Amylin在ORG發生發展的過程中發揮重要作用，其機制有待于進一步研究，并可能成為DN和ORG新的治療靶點。

1 Kambham N，Markowitz GS，Valeri AM，et al.Obesity-related glomerulopathy:an emerging epidemic〔J〕.Kidney Int，2001;59(14):1498-509.

2 張 強，武明虎，張曉東.肥胖相關性腎病大鼠模型的建立及評價〔J〕.山西醫科大學學報，2008;39(4):317-320.

3 Roth JD，Trevaskis JL，Wilson J，et al.Antiobesity effects of the beta-cell hormone amylin in combination with phentermine or sibutramine in dietinduced obese rats〔J〕.Int J Obes，2008;32(8):1201-10.

4 陳惠萍，朱茂艷，張 波.肥胖相關性腎病〔J〕.腎臟病與透析腎移植雜志，2002;11(3):291-4.

5 張建江，易著文，楊華彬.肥胖相關性腎病的診斷〔J〕.實用兒科臨床雜志，2006;21(5):316-7.

6 譚會斌，傅淑霞.肥胖相關性腎病發病機制的研究進展〔J〕.河北醫科大學學報，2009;30(1):92-4.

7 Ehrlich JC，Ratner IM.Amyloidosis of the islets of Langerhans，Arestudy of islet hyalin in diabetic and non-diabetic individuals〔J〕.Am J Pathol，1961;38(1):49-59.

8 龔 偉，劉志紅，彭 艾，等.糖尿病腎病組織胰淀素沉積及其致病意義〔J〕.腎臟病與透析腎移植雜志，2006;15(3):210-8.