正交試驗優選槐角總黃酮的提取工藝及不同來源槐角中總黃酮的含量測定*

韋華梅 閆騰蛟 林宜沛 王劍波 第四軍醫大學藥學系藥物研究所 (西安 710032)

中藥槐角為豆科植物槐(Sophora japonica L.)的干燥成熟果實,又名槐實(《本經》),槐子 (陶弘景 ),槐豆 (《本草原始》),槐連燈、九連燈、天豆 (《河南中藥手冊》),槐連豆(《中藥材手冊》)[1]。傳統中藥學認為其性寒、味苦;歸肝、大腸經,具有清熱瀉火,涼血止血的功效。臨床主要用于腸熱便血、痔腫出血,肝熱頭痛、眩暈目赤[2],為《中華人民共和國藥典》歷版收載品種。近年來國內外醫藥工作者對其進行多方面的研究。尤其是槐角中富含異黃酮類化合物的特點,使其成為國際上研究和開發的熱點。國內外學者對槐角屬藥用植物的化學成分及生物活性進行了一系列研究,從槐角中提取主要含黃酮類和異黃酮類化合物,其中有染料木素、槐屬苷、槐屬雙苷、山奈酚糖苷-C、槐屬黃酮苷和蕓香苷,蕓香苷的含量很高,另含槐糖、油酸、亞油酸和亞麻酸等一些化學物質[3]。本文參考有關文獻[4-7],采用正交試驗法優化槐角提取物中總黃酮含量的提取工藝,用優化出的最佳工藝對陜西不同時期不同產地槐角提取物中總黃酮含量進行測定。

1 儀器與材料 1.1 儀器 紫外可見分光光度計(SPECORD200),電子天平(LT202E,常熟市天量儀器有限公司),旋轉蒸發儀(陜西泰康生物科技有限公司),Sartorius電子分析天平(德國沙多利斯公司)等。

1.2 材料 槐角苷對照品(中國藥品生物制品檢定所批號:111695-200501);槐角樣本(陜西地道中藥材種植有限公司)等。

2 方法與結果 2.1 正交設計提取因素與水平

在考察單因素影響的預試驗的基礎上,選擇乙醇作為提取溶劑,以乙醇濃度、提取次數、提取時間和溶媒體積為考察因素,各因素設定 3個水平,見表1。

表1 因素與水平

2.2 總黃酮含量測定方法學研究 2.2.1 供試品溶液的制備:稱取槐角 A2藥材 60.05g,置 100m L圓底燒瓶中,用8倍量60%乙醇加熱回流提取3次,每次2h,趁熱抽濾,合并濾液,減壓回收溶劑,浸膏減壓干燥至恒重。將槐角提取物在研缽中研碎后精密稱取槐角提取物1mg至10m L容量瓶中,加70%乙醇適量,50℃水浴加熱溶解,冷卻至室溫,稀釋至刻度。精密量取1m L于 10m L容量瓶中,加 70%乙醇稀釋至刻度,搖勻,即制得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備:精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥 12h以上的槐角苷對照品 4.13mg置 100m L容量瓶中,加 70%乙醇稀釋至刻度,搖勻,即制得對照品溶液。

2.2.3 測定波長的選擇:以 70%乙醇作空白對照,在200～400波長范圍內掃描供試品溶液和對照品溶液,結果表明二者均在 263nm處有最大吸收,因此確定263nm為測定波長。

2.2.4 標準曲線的制備:精密量取對照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6 m L分別置于10m L容量瓶中,加70%乙醇稀釋至刻度,搖勻。以70%乙醇作空白,于 263 nm處測定吸光度,以對照品的濃度和吸光度數據經回歸處理,線性回歸方程為 y=0.0846x+0.0143,r=0.9995。結果表明:槐角苷質量濃度在0.826mg/L～6.608mg/L范圍內線性良好。實驗數據見表2。

表2 標準曲線數據

2.2.5 精密度試驗:取濃度為 1.652mg/L的槐角苷標準品溶液,重復測定 6次,吸光度值均為 0.16,計算 RSD為0.00%,結果表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗:取供試品溶液分別于0,0.5,1,1.5,2,2.5 h測定其吸光度值,吸光度值均為0.19,RSD為 0.00%,結果表明本法所測樣品在 2.5h內穩定。

2.2.7 重復性試驗:分別精密稱取8倍量 60%乙醇槐角提取物 1mg,平行 5份,按“2.2.1”項下操作,測定吸光度值,計算總黃酮的百分含量,RSD為 1.58%,結果所測樣品的重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗:精密稱取8倍量 60%乙醇槐角提取物 0.00123g、0.00087g、0.00135g分別置10m L容量瓶中,加 70%乙醇適量,50℃水浴加熱溶解,冷卻至室溫,稀釋至刻度。分別精密量取兩個1m L于兩個 10m L容量瓶中 ,編號為 1、2、3、4、5、6,依次加入槐角苷標準溶液 0.70m L、0.75m L、0.50m L、 0.53m L、0.61m L、0.68m L,加 70%乙醇稀釋至刻度 ,搖勻,即得。測定吸光度值并計算回收率和RSD。結果見表3。

表3 回收率試驗結果

上述結果表明,紫外分光光度法測定總黃酮含量,方法可靠,定量準確。

2.3 正交試驗結果 稱取槐角 A2藥材每份50g,按L9(34)正交表4設計方案進行試驗[2]。結果見表4和表5。

表4 L9(34)正交表試驗結果

表5 方差分析

根據表4對測定結果進行直觀分析數據可知,各因素對提取效果的影響程度為 A＞B＞ C＞D,即乙醇濃度＞提取次數＞提取時間＞乙醇用量,A3 B3 C2 D1為最佳工藝。方差分析可知,乙醇濃度A和提取次數B槐角總黃酮的提取有顯著性影響,提取時間和乙醇用量對總黃酮的提取沒有太大的影響,考慮生產中節約成本,節省時間,提高效率,提取時間和乙醇用量對其總黃酮含量影響不是非常大,所以用 C1代替 C2,即A3 B3 C1 D1為最優工藝,即 8倍量65%乙醇回流提取 3次 ,每次 1h。

2.4 驗證試驗 為進一步考察優化工藝的可靠性,取 3份藥材,每份 50g,按上述最佳提取工藝A3 B3 C1 D1進行驗證試驗,操作方法同上,測定結果見表6。結果表明此最佳工藝條件合理,同時也表明此工藝具有較好的穩定性。

表6 驗證試驗結果

2.5 總黃酮的含量測定 2.5.1 樣品來源及編號:將延安宜川、榆林清澗、渭南蒲城、咸陽旬邑、寶雞隴縣5個地區作為采集供試樣點。供試樣的要求為不同產地同一時間采集,并且 8月一個產地 1個樣(開花期,樣本多缺失),9、10、11月為一個產地不同時期(上、下旬)2個樣。將產地按 A榆林、B延安、C渭南、D咸陽、E寶雞進行編號,每個產地的 7個樣編為 0～6號。編號見表7。

表7 槐角樣品編號情況

2.5.2 總黃酮的含量測定:按照優化工藝優選的方法對各個槐角樣品進行提取,并對提取物中的的總黃酮含量進行測定,測定結果見表8。

表8 總黃酮含量測定結果

2.6 討 論 通過測定陜產槐角總黃酮含量,發現不同來源的樣品總黃酮的含量有一定差異。經比較陜北黃土高原溝壑區榆林清澗與延安宜川 9月下旬槐角總黃酮含量最高,渭北黃土高原溝壑區11月上旬槐角總黃酮含量較高,這可能與日照時間、溫度、海拔和干旱等因素有關。此研究為陜西產槐角的資源利用和開發提供實驗依據。

[1] 南京中醫藥大學.中藥大辭典 [M].上海:科學技術出版社,2437.

[2] 中華人民共和國藥典委員會.中國藥典(2010版一部)[S].北京:化學工業出版社,2010:334.

[3] 王景華,唐于平,樓鳳昌,等.槐角化學成分與藥理作用 [J].國外醫藥:植物藥分冊,2002,17(2):58-60.

[4] 馮衛生,趙獻敏,王彥志,等.正交設計優選卷柏中總黃酮的提取工藝研究 [C].中草藥,2009,40(6):893-895.

[5] 張蕓蘭,王文淵.正交設計法優選杜鵑花中總黃酮的提取工藝 [J].廣州化工 ,2009,37(3);134-136.

[6] 冉曉燕,胡德禹,薛 偉.槐角中總黃銅的提取工藝研究 [J].貴州教育學院學報 ,2009,20(6):22-24.

[7] 莊志軍,鐘方麗,楊英杰,等.刺玫果中總黃酮的提取與分析 [J].中成藥,2007,29(9):1394-1396.