DPPH法篩選大血藤抗氧化活性有效部位*

馮改利 宋小妹 鄧 羽中 豆 勇 陜西中醫(yī)學院(咸陽 712046)

大血藤(Cau lis Sargentodoxae)為大血藤科植物大血藤(Sargentodoxacuneata(Oliv.)Rehd.Et W ils.)干燥莖,主產(chǎn)于河南、安徽、江蘇、浙江、湖北、四川、甘肅等省。其藤莖具有清熱解毒、活血通經(jīng)及祛風除濕等功效,用以治療腸癰腹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、風濕痹痛、跌打撲痛[1]。據(jù)文獻報道,大血藤化學成分主要以酚酸類為主,酚酸類一般具有抗氧化的活性[2-3]。本實驗擬采用 DPPH抗氧化體外實驗的方法,篩選大血藤抗氧化的活性部位。為大血藤藥理研究和臨床應用提供參考。

1 實驗材料 1.1 試藥 UV 1102紫外分光光度計(上海天美科學儀器有限公司);電子天平(薩多利斯 GB2042電子天平(瑞典);藥材產(chǎn)自四川省地,經(jīng)陜西中醫(yī)學院學生藥系王繼濤高級實驗師鑒定為木通科大血藤植物 Sargentodoxa cuneata(Oliv.)Rehd.Et W ils.的干燥莖;抗壞血酸(天津市天力化學試劑有限公司,批號:2010608);2,2-二苯基-1-苦味基肼自由基(DPPH)(批號:CR0032);水為純凈水,其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果 2.1 樣品的制備 2.1.1 供試品的制備:取大血藤藥材飲片200 g,分別以 10倍量和8倍量的水煎煮2次,合并提取液,于 90℃水浴濃縮至500m L。分別以三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇200、200、200m L萃取 3次,萃取液于 90℃濃縮至干,以無水乙醇溶解,定容于50m L量瓶中。萃取剩余藥液定容至500m L,取100m L,加乙醇至醇濃度到50%,靜置,過濾,于 90℃濃縮至干,以50%乙醇定容于 25m L量瓶,配制成相當于生藥濃度 4 g? m L-1,于-4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

精密稱取抗壞血酸 250.11 mg,用無水乙醇溶解定容于 50m L量瓶中,定容得 5.0022 mg? m L-1貯備液,置于冰箱中冷藏備用。

2.1.2 對照品的制備:精密稱取 DPPH約 3.5m g,用無水乙醇溶解,定容于 50 m L量瓶中,置于冰箱中冷藏備用(臨用時配,只能穩(wěn)定存在 5 h,深藍色 )。

2.2 抗氧化實驗測定方法 測定原理:DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基,其乙醇溶液呈紫色,并在 517 nm處有強烈吸收,在有自由基清除劑存在時,自由基清除劑提供一個電子與 DPPH的孤對電子配對,而使其褪色,褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系,在 517 nm處的吸光度變小,其變化程度與自由基清除程度呈線形關(guān)系,即自由基清除劑的清除自由基能力越強,吸光度越小[4]。

測定方法:用移液管取2m L已知濃度乙醇,再取2 m LDPPH溶液充分振搖。30min后,于517 nm處測吸光度 A值(Ac);用移液管取樣品溶液2m L。再取2m L已知濃度乙醇,充分振搖。30min后,于517 nm處測吸光度 A值(Aj);用移液管取樣品液 2m L,再取 2m L DPPH溶液,充分振搖振蕩。室溫下靜置 30m in,測吸光度 A值(Ai)。平行測定2次計算清除率:K=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。 K為自由基清除劑對 DPPH自由基的清除率;Ai為加試樣反應后 DPPH溶液吸光度;Aj為不加DPPH,只加試樣的溶液的吸光度;Ac為不加試樣,只加 DPPH溶液的吸光度[5]。

2.3 DPPH自由基穩(wěn)定性試驗 將配制一定濃度的DPPH乙醇溶液在室溫下放置 60 min以上,每隔10min測其吸光度。在室溫下放置60m in,其吸光度變異系數(shù)為0.2%。結(jié)果表明DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基,可用以提取物抗氧化活性的分析。

2.4 DPPH吸光值與濃度關(guān)系 分別精密移取0.6、0.9、 1.2、1.5、1.8、2.1m LDPPH對照品溶液至10 m L量瓶,用無水乙醇稀釋定容,分別得 0.072、0.108、0.144、0.18、0.216、0.252 mg? m L-1標準溶液。再分別吸取 2 m L系列標準溶液,按照“2.2”項下測定方法進行測定。以 DPPH質(zhì)量濃度為橫坐標,吸光度(UV)為縱坐標繪制標準曲線,得吸光度與DPPH質(zhì)量濃度的線性回歸方程為Y=3.0587X+0.0078,R2=0.9997。 DPPH在 0.072～ 0.252 mg? m L-1之間線性相關(guān)。

2.5 陽性對照品清除 DPPH自由基試驗 精密量取抗壞血酸標準品溶液1.0m L,依次稀釋為原標準液的 1/100,1/200,1/400,1/600,1/800,1/1000,再分別吸取 2m L系列標準溶液,按照“2.2”項下測定方法進行測定。抗壞血酸自由基清除作用與濃度相關(guān),隨濃度升高而升高,結(jié)果見表1。

2.6 大血藤各萃取部位清除 DPPH自由基研究

將各萃取部位的乙醇溶液按照一定的濃度梯度依次稀釋,分別與 2.0m LDPPH溶液混合,振搖 30 s,靜置30 min測定吸光度,計算清除率。以抗壞血酸為參照物對各部位的抗氧化活性進行比較。由表2可知,于抗壞血酸的質(zhì)量濃度相當時,只有大血藤的正丁醇與水部位都具有顯著的抗氧化活性,乙酸乙酯和三氯甲烷部位不具有顯著的抗氧化活性。

表1 陽性對照品對DPPH自由基清除率

表2 大血藤各部位對 DPPH自由基清除率

圖1 抗壞血酸及各提取物與 DPPH反應時間對DPPH清除率的關(guān)系

2.7 抗壞血酸及各提取物與 DPPH反應時間對DPPH清除率的影響 各部位萃取物同一濃度(4 mg? m L-1)2.0 m L與DPPH混合后分別在0,2.5,5,7.5,10,20,30,40,50,60min測定其吸光度,計算清除率,考察反應終點及反應穩(wěn)定性。結(jié)果見圖1。3 討 論 本實驗以體外DPPH法為評價方法,以抗壞血酸作為參照物,研究大血藤不同萃取部位抗氧化活性,研究表明:正丁醇萃取部位和水部位在DPPH自由基清除體系中活性最強,乙酸乙酯部位稍低,三氯甲烷部位抗氧化活性最低。據(jù)文獻報道,大血藤在同 45味具有抗氧化活性中藥比較,顯示具有最強的抗氧化活性[2]。為本實驗的研究提供了依據(jù)。

本研究抗氧化活性比較是建立在抗壞血酸單位質(zhì)量和大血藤單位生藥量的基礎(chǔ)上,相對于抗壞血酸而言,大血藤相當?shù)纳帩舛鹊目寡趸钚月匀?從而側(cè)面體現(xiàn)若大血藤有效部位經(jīng)提取和純化,能夠開發(fā)成為一種具有市場潛力的抗氧化劑。

[1] 陸連英.《本草綱目》中紅藤本草考證 [J].時珍國醫(yī)國藥,2000,11(2):170-170.

[2] 李華彬,將 躍,王赤春,等.中藥提取物的體外抗氧化性能和總酚含量[J].中華文化論壇,2008,8,256-259.

[3] 李鈞敏,金則新,陳 彤,等.紅藤飲片提取物抑菌活性與次生代謝產(chǎn)物含量的相關(guān)性[J].浙江大學學報(醫(yī)學版),2006,35(3):273-280.

[4] 王 晶,李 麗,劉春明,等.不同紅藥提取物中總酚的測定及抗氧化活性的 DPPH法評價研究 [J].遼寧中醫(yī)雜志,2011,38(3):513-515.

[5] 趙 爽,嚴銘銘,趙大慶,等.小飛蓬總黃酮提取工藝優(yōu)選及體外抗氧化活性研究 [J].中成藥,2011,33(2):348-350.