參仙生脈口服液 HPLC指紋圖譜研究

楊娟英 林玉紅 謝 偉 王月茹 陜西步長制藥有限公司 (西安 710075)

參仙生脈口服液是由紅參、淫羊藿、枸杞子、補骨脂等藥材組成,具有溫補心腎,活血化瘀之功效。用于陽虛脈遲癥,癥見脈遲、脈結、心悸、胸悶、胃寒肢冷、腰膝酸軟、氣短乏力等癥,對于現代醫學中病竇綜合癥及竇性心動過緩等類型心律失常具有良好的治療效果。由于該制劑涉及的藥材種類較多、化學成分相對復雜,各味藥材易受產地、藥用部位、采收時間、提取工藝等因素的影響,為有效的控制及評價該制劑的質量帶來了一定的困難。指紋圖譜反映的是樣品整體的特征的質量評價方法[1、2],本試驗擬建立該制劑的中藥高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。實驗中采用全波長檢測法,最終建立了參仙生脈口服液 HPLC指紋圖譜,為科學、合理的評價及有效的控制該制劑的質量提供了可行的參考方法。

1 儀器與試藥 1.1 儀 器 Waters 2695高效液相色譜儀,Empow er色譜工作站,2996二極管陣列檢測器;HB3120U型數控超聲波發生器;Sartorius BT125D電子天平。

1.2 試 藥 人參皂苷 Rg1對照品,人參皂苷Rb1對照品,淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供);參仙生脈口服液 10批(批號 100302,100303,100304,100601,100602,100603,101201,101202,101203,101204)由山東步長制藥有限公司生產提供;甲醇、乙腈均為色譜純,其他試劑均為分析純。

2 方法與結果 2.1 色譜條件 色譜柱:K romosilODSC18(5μm,4.6mm× 250mm);流動相:乙腈 (A)-水(B)梯度洗脫:0～ 20min(A:10%→20%),20～ 40min(A:20%→ 30%),40～ 65min(A:30%→38%);全波長檢測;柱溫:30℃;流速,1.0m L/min。

2.2 對照品溶液的制備 取人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Rb1、淫羊藿苷對照品適量,至于量瓶中,加甲醇制成每 1m L含 0.5mg的溶液,作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品 10m L,用D101型大孔吸附樹脂柱吸附,然后用100m L蒸餾水洗脫,棄去水洗液;用 70%乙醇 50m L洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘渣加甲醇適量使溶解,并轉移至5m L量瓶中定容,用 0.45μm的微孔濾膜過濾,取續濾液,即得。

2.4 測定方法及數據處理 精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL,進樣,記錄120min的色譜圖,采用國家藥典會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)”,經過數據導入,點校正和數據匹配,將多個批次的樣品色譜圖進行比較,得到可全面反映多個色譜圖特征的參仙生脈口服液的對照指紋圖譜,根據峰匹配結果,以峰面積為參數,計算出各樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜(R)的整體相似度,結果越接近1即相似度越高。

2.5 穩定性、精密度和重復性考察 取同批樣品,按照“2.2.3”項方法制備供試品溶液 ,分別在 0、 2、4、 6、 8、 10、 12、 24h時測定 ,觀察各峰的 tR、峰面積比值的變化及圖譜的相似度。結果表明:各共有峰的 tR、峰面積的比值及色譜相似度基本穩定(RSD＜2.0,相似度為＜0.920),符合指紋圖譜制定的要求;取同一批樣品 6份,按照“2.2.3”項方法制備供試品溶液,測定指紋圖譜;6次測定結果穩定,各共有峰的 tR、峰面積的比值及色譜相似度基本一致(RSD＜1.21,相似度 ＜0.990)。以上實驗結果表明:本方法的穩定性、精密度和重復性良好。

2.6 共有指紋峰的標定和相似度的計算 取 10批復方紅景天口服液樣品,分別按照“2.2.3”項方法制備供試品溶液,在上述色譜條件下,測定其色譜圖,結果見圖 1、2和附表。

圖110 批參仙生脈口服液HPLC指紋圖譜

圖2 參仙生脈口服液HPLC對照指紋圖譜

附表10批參仙生脈口服液 HPLC指紋圖譜相似度計算結果

3 討 論 目前,中藥制劑 HPLC指紋圖譜多以單一波長下指紋圖譜為依據,不能同時反映特征吸收波長不同的多指標成分的化學信息。為了能更深入的反映本檢測樣品指紋信息的整體性、特征性,更全面的控制該制劑的質量,本試驗采用全波長檢測法對待測樣品的指紋圖譜進行考察,結果發現在254nm處樣品信息較為全面,并且峰形好,分離度高,響應值較大。

相似度是聚類分析中的一個基本概念[3、4],它反映了研究對象之間的親疏程度,聚類分析就是根據研究對象之間的相似性來進行分類的。在聚類分析技術的發展過程中,形成了很多種測度相似性的方法。其中距離測度的出發點是把每個案例看作 m維空間中的一個點,在 m維空間中定義點與點之間的距離,距離越近的點,相似程度越高,聚類時更可能歸為一類。指紋圖譜反映的是樣品整體的特征,進行指紋圖譜的比較,可以反應樣品之間的親疏程度,但是單純的直觀比較指紋圖譜的峰的多少和峰的大小,只是定性比較,而且又帶有個人的主觀性。相似度可以定量地描述指紋圖譜,本實驗中用相似度分析軟件對參仙生脈口服液 10個批次進行比較,根據其色譜指紋圖譜建立對照指紋圖譜(共有模式),計算樣品與對照指紋圖譜的相似度算結果均在0.99以上,RSD為0.3%,并且對各色譜圖進行色譜峰匹配,結果初步確立了10個共有峰,其中 3個已標定,因此我們將在今后的研究過程中,繼續確定其他共有峰的歸屬,這將為本產品的質量評價的提高提供基礎和依據。

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