消旋丁苯肽對血管性癡呆大鼠認知功能的影響*

王義義 許 靜 楊 卓

血管性癡呆（VD）是腦血流減少引起的腦組織損傷所導致的進行性記憶以及認知功能的損傷。在英美國家中，其發病率僅次于阿爾茨海默病（AD）[1]。VD表現為進行性的認知功能下降，影響患者的生活質量，同時也給監護人帶來困難。消旋丁苯肽（dl-NBP）是從天竺葵屬植物芹菜籽中提取的成分，dl-NBP包括左旋丁苯肽和右旋丁苯肽，主要用于中風的治療。在治療卒中的研究中發現dl-NBP可改善微循環[2]并減少神經元的凋亡[3]。以上作用機制也是參與VD疾病中神經元損傷的機制[4]。本研究旨在評價dl-NBP對VD的認知障礙是否有改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠 成年雄性健康清潔級Wistar大鼠30只，體質量200～250 g，購于軍事醫學科學院實驗動物中心。隨機分為對照組、VD組和VD給予dl-NBP干預（VD+dl-NBP）組，每組10只。

1.2 動物模型制造 實驗采用雙側頸總動脈永久性結扎（2VO）結合高脂喂養的方法造模。首先對VD組和VD+dl-NBP組大鼠進行高脂飼料（購自天津市利居生物用品有限公司）喂養3周，然后進行雙側頸總動脈永久性結扎手術。使用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，頸部皮膚備皮，碘伏消毒后沿中線切開約1.5 cm的切口，找到并游離雙側頸總動脈，結扎。70%乙醇消毒后縫合傷口，將大鼠放回籠中飼養，自由攝食水。對照組大鼠僅手術切開頸部皮膚和皮下組織后便縫合，放回籠中飼養。VD+dl-NBP組大鼠手術后當天開始給予dl-NBP（40 mg/kg）灌胃，1次/d，共30 d。

1.3 Morris水迷宮（MWM）實驗 造模后第30天進行MWM實驗，用于評價大鼠空間學習和記憶的能力。實驗設備包括一個圓形的水池，充滿水（約60 cm深）并用墨汁將水染黑。水池以假想的十字線分為4個象限，分別以1、2、3、4代表。將一個直徑10 cm的平臺置于水面下1.5 cm。MWM實驗分為2部分：定位航行實驗和空間搜索實驗。定位航行實驗歷時5 d，每天分上、下午兩段，上下午各訓練4次，從4個象限分別放大鼠入水。平臺放在第二象限。共訓練8次。記錄大鼠爬上平臺所需時間（逃避潛伏期，escape latency）。如果大鼠在60 s內未找到平臺，則將其引至平臺，并保持5 s，潛伏期記為60 s。整個實驗過程中，水池周圍參照物位置不變。空間搜索實驗用于觀察大鼠對平臺空間位置記憶的能力。即在實驗的第6天撤除平臺，將大鼠放入水中，測其在60 s內在原平臺象限搜索時間占總游泳時間（60 s）的百分比。

1.4 記錄海馬區CA3-CA1長時程增強（LTP） 在MWM結束后當天，大鼠經30%烏拉坦（4 mL/kg）麻醉后，進行LTP記錄。首先將頭固定于頭顱立體定位儀（Narishinge，Japan）。在大鼠頭頂部切開大約1.5 cm切口，暴露顱骨。定位刺激電極和記錄電極的位置，刺激電極位置在前囟后4.2 mm,中線旁3.5 mm；記錄電極在前囟后3.5 mm，中線旁2.5 mm。在電極位于顱骨的投影處將顱骨打開，掀去硬腦膜，將刺激電極和記錄電極輕輕插入左側海馬，電極深度根據生理學標準確定[5]。在scope軟件中記錄場興奮性突觸后電位（fEPSP）。20 min基礎的fEPSP記錄后，給予高頻刺激（HFS，10 Hz的串刺激，脈沖組數為10，主周期為2 s，重復次數為10）。然后再記錄60 min。以基礎fEPSP后5 min的斜率為基值，以HFS誘導后50～60 min的fEPSP的斜率除以基值來表示LTP的幅值。

1.5 統計學處理 統計學分析采用SPSS 16.0軟件。數據以均數±標準差±s）表示。MWM中定位航行階段組間比較采用重復測量方差分析，其他數據3組比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮

2.1.1 定位航行實驗結果比較 在前5 d的定位航行階段，3組大鼠的逃避潛伏期組間比較差異有統計學意義（均P<0.01），不存在交互效應（P>0.05）。VD組低于對照組和VD+dl-NBP組，差異均有統計學意義（均P<0.01），見表1。

表1 3組大鼠逃避潛伏期比較 （n=6，s±s）

表1 3組大鼠逃避潛伏期比較 （n=6，s±s）

F組內 =39.549，F組間=11.361，均P<0.01；F交互 =0.133，P>0.05

組別對照組（1）VD組（2）VD+dl-NBP組（3）第1天26.25±4.16 36.59±6.88 27.40±1.66第2天11.69±2.09 23.14±5.79 11.35±1.82第3天7.52±0.94 18.53±4.32 8.54±1.07 5.29±0.75 15.18±4.42 6.50±1.33組比（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）P 0.001 0.672 0.001統計學處理5.84±0.89 15.04±2.73 7.99±1.17對照組（1）VD組（2）VD+dl-NBP組（3）組別 第4天 第5天

2.1.2 空間搜索實驗 在第6天的測試階段，對照組、VD組及VD+dl-NBP組的目標象限百分比分別為（51.1±2.87）%，（37.03±3.50）%，（54.42±3.06）%。差異有統計學意義（F=12.03，P<0.01）。VD組低于對照組（P=0.02）和VD+dl-NBP組（P<0.001），見圖1。

2.2 3組長時程增強結果比較 由HFS誘發的長時程增強，箭頭所指為給予HFS的時點，見圖2a。對照組、VD組和VD+dl-NBP組的LTP幅值分別為（133.4±10.1）%、（108.4±16.9）%和（120.5±7.3）%，差異有統計學意義（F=94.21，P<0.01）。VD組低于對照組和VD+dl-NBP組，差異均有統計學意義（均P<0.001），見圖2b。

3 討論

血管性癡呆是最常見的癡呆之一，缺血性血管疾病是引起VD的主要原因。VD的動物模型最為常用的造模方法是血管閉塞方法，其中雙側頸總動脈結扎的方法操作簡單，有利于慢性病程的觀察[6]。在雙側頸總動脈結扎的基礎上給予高脂飼養，是一種改良的VD動物模型，VD大鼠表現出的智能障礙和行為學改變更加明顯[7]。因此本研究使用雙側頸總動脈結扎結合高脂喂養的方法建立血管性癡呆模型。LTP是指突觸連接前后兩個神經元之間信號傳遞的長時間的增強。是學習記憶的分子模型[8]。MWM是一種廣泛用于測定大鼠空間學習記憶的行為學實驗[9]。MWM和LTP的實驗結果表明VD組大鼠與對照組大鼠比較，逃避潛伏期明顯延長，目標象限百分比以及LTP均明顯下降，大鼠表現出明顯的學習記憶能力的下降，提示造模成功。

目前用于治療VD的藥物有很多類，如膽堿酯酶抑制劑、腦細胞代謝賦活劑、鈣拮抗劑、麥角生物堿制劑、神經營養因子、血管擴張劑等[10]。但是還沒有滿意的預防以及治療VD的藥物。丁苯酞又名芹菜甲素，是從芹菜籽中分離出的有效成分，其有效機制涉及腦缺血病理的多個環節,對缺血性卒中具有較強的治療作用。在MWM定位航行階段以及空間搜索階段的研究中，VD+dl-NBP組大鼠的逃避潛伏期以及目標象限百分比，與VD組大鼠比較都有非常明顯的改善，提示dl-NBP具有改善VD大鼠學習和記憶的作用。在電生理實驗中，數據顯示VD+dl-NBP組大鼠的LTP較VD大鼠明顯提高，海馬LTP是學習記憶的分子基礎。因此提示dl-NBP具有改善VD大鼠的LTP，對于大鼠的空間學習和記憶能力起到提高的作用。

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