外周血中基質金屬蛋白酶及其抑制物與反復流產的關系

謝立敏，徐 海，于文晶，周 嵐，伊心浩，張建海，于云英，安 娜

(勝利油田中心醫院，山東東營257034)

基質金屬蛋白酶(MMPs)是參與細胞外基質降解和重塑正常組織的重要酶類，正常情況下MMPs和其組織抑制物(TIMPs)維持著一個動態平衡，該平衡對妊娠建立極為關鍵。本研究通過測定反復自然流產患者外周血及蛻膜中MMP-9/TIMP-1的表達，探討不明原因反復流產患者的病因及發病機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年10月～2010年12月在勝利油田中心醫院婦產科就診的反復流產患者30例(試驗組)，年齡26～38歲。隨機選擇同期行人工流產的正常健康早孕婦女30例(對照組)，年齡25～36歲;妊娠周數均≤8周，無慢性高血壓、肝腎及血液系統疾病及急性炎癥。兩組年齡、健康狀況均無統計學差異(P＞0.05)。

1.2 方法 人血漿MMP-9和TIMP-1酶聯免疫吸附試劑盒均為美國R＆B SYSTEMS公司產品，深圳晶美生物工程公司提供，實驗操作按照說明書進行;鏈霉菌抗生物素—過氧化酶試劑盒購自福州邁新公司。試驗組及對照組均于流產前1 d采集肘靜脈血4 ml，肝素抗凝，30 min內2～8℃常溫下1 000 r/min離心 15 min，取部分上清測 TIMP-1。余液10 000 r/min再次離心10 min，取上清測 MMP-9。所有標本置于-20°保存備用。①外周血中MMP-9及TIMP-1檢測:用標準稀釋液分別梯度稀釋標準品;在抗MMP-9及抗TIMP-1預包被板上分別加入標準品稀釋液100μl至空白孔和零孔，待測標本和不同濃度的標準品各100μl至相應孔中，37℃孵育1 h;加入生物素標記的二抗100μl，37℃孵育2 h;加入已稀釋的酶結合物100μl，37℃孵育30 min;再加入底物50μl，避光，37℃孵育15 min，每孔加入終止液50μl，450 nm波長下比色。②絨毛及蛻膜組織MMP-9及TIMP-1檢測:所得絨毛及蛻膜組織用生理鹽水沖洗后，立即放入4%多聚甲醛液中固定，常規脫水，石蠟包埋，統一切片、HE染色、免疫組織化學染色。

1.3 結果判斷 ①外周血中MMP-9及TIMP-1結果判定:以吸光度為縱坐標，MMP-9及TIMP-1含量為橫坐標，繪制標準曲線，根據標準曲線求出待測樣品中MMP-9及TIMP-1含量，兩組間進行比較。②絨毛及蛻膜組織MMP-9及TIMP-1結果判定:采用4級半定量積分法進行結果判定。

1.4 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件，兩組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血MMP-9及TIMP-1水平 試驗組外周血MMP-9水平明顯高于正常對照組(P均＜0.05)，而 TIMP-1 無統計學差異(P 均 ＞0.05)，試驗組MMP-9/TIMP-1明顯高于對照組(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組外周血MMP-9及TIMP-1水平比較(±s)

表1 兩組外周血MMP-9及TIMP-1水平比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

MMP-9/TIMP-1試驗組 30 3.30 ±3.56* 0.82 ±0.21 5.31 ±1.78組別 n MMP-9(ng/ml)TIMP-1(ng/ml)*對照組30 2.21 ±1.26 0.93 ±2.76 2.38 ±4.51

2.2 兩組蛻膜組織中MMP-9及TIMP-1水平 試驗組蛻膜中MMP-9水平明顯高于對照組(P均＜0.05)，而 TIMP-1 無統計學差異(P 均 ＞0.05)，試驗組MMP-9/TIMP-1明顯高于對照組(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組蛻膜組織中MMP-9及TIMP-1水平比較( ± s)

表2 兩組蛻膜組織中MMP-9及TIMP-1水平比較( ± s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

MMP-9/TIMP-1試驗組 30 169±32* 94±23 1.6±0.5組別 n MMP-9(pmol/L)TIMP-1(pmol/L)*對照組30 101 ±21 93 ±36 1.0 ±0.3

3 討論

胚胎植入是妊娠的關鍵環節。首先，子宮內膜蛻膜化是胚胎成功植入的先決條件，在早孕期抑制MMPs會限制基質細胞蛻膜化［1］。其次，滋養細胞的侵襲能力對于早期胚胎植入及胎盤形成至關重要。MMPs對ECM的降解是滋養細胞侵襲的限速步驟［2］。這一方面與隨著妊娠的進展MMPs產生減少，滋養細胞的侵襲能力下降有關;另一方面，MMPs的特異性抑制劑TIMPs也能降低滋養細胞的侵襲能力［3］。胚胎滋養層和蛻膜同時合成的 MMPs和TIMPs之間的相互調控和平衡是維持正常妊娠的重要條件。

Iwashashi等［4］比較了自然流產和正常分娩孕婦的蛻膜組織中的膠原含量，發現自然流產者Ⅳ型、Ⅴ型膠原的含量較正常分娩者明顯減少。由于Ⅳ型、Ⅴ型膠原是MMP-9的底物，故提示MMP-9有可能水解Ⅳ型、Ⅴ型膠原，使蛻膜組織壞死脫落，進而促發流產。孕激素通過MMPs介導作用在該過程中起重要作用［5］，若該作用異常，則可導致流產。如果滋養細胞侵蝕不足，則螺旋動脈尚可保留其收縮功能，使過多的血液流向絨毛間隙，對發育中的胚胎和胎盤增加壓力，這可能是導致自然流產的原因。本研究中反復流產患者絨毛組織中MMP-9/TIMP-1明顯偏移，且與外周血液MMP-9/TIMP-1變化一致，說明其在反復流產的發病過程中發揮重要作用。但TIMP1含量無統計學差異，其具體原因需進一步研究。

總之，成功的著床需要MMPs/TIMPs的平衡表達。多次著床失敗患者可能存在MMPs和TIMP的表達異常，這為反復流產的研究提供了新的思路。

［1］Strakova Z，Szmidt M，Srisuparp S，et al.Inhibition ofmatrixmetalloproteinases prevents the synthesis of insulin-like growth factor binding protein-1 during decidualization in the baboon［J］.Endocrinology，2003，144(12):5339-5346.

［2］Campbell S，Rowe J，Jackson CJ，et al.In vitromigration of cytotrophoblasts through a decidual endothelial monolayer:the role of matrixmetallo proteinases［J］.Placenta，2003，24(4):306-315.

［3］Isaka K，Usuda S，Ito H，et al.Expression and activity ofmatrix metalloproteinase 2 and 9 in human trophoblasts［J］.Placenta，2003，24(1):53-64.

［4］Iwashashi M，Nakano R.Decreased type V collagen expression of spontaneous abortion during early pregnancy［J］.J Clin Pathol，1998，51(1):44-46.

［5］Osteen KG，Bruner TK，Keller NR，et al.Progesterone-mediated endometrialmaturation limits matrix metalloproteinase(MMP)expression in an inflammatory-like environment:aregulatory system altered in endometriosis［J］.Ann NY Acad Sci，2002，955(3):37-47.