基因芯片技術分析血管緊張素原基因多態性與冠心病的關系

馬 娟，李勇國，王 瑋，田 青

（昆明市第一人民醫院 心內科，云南 昆明 650011）

冠心病(CHD)是由遺傳和環境因素共同作用所致的復雜疾病。國外的研究大部分表明AGT基因變異與CHD具有相關性[1]，T等位基因是CHD發病的危險因素，但也有一部分人認為二者無關[2]，少數人則得出相反的結論[3]。我國對于二者關系的研究甚少，結論尚存在爭議。本研究應用基因芯片技術檢測AGT基因的M235T多態性，并比較其基因型及等位基因頻率，旨在探討人群AGT基因多態性和CHD的關系。

對象與方法

對象：2005～2006年期間昆明市第一人民醫院心內科收住的CHD患者100例，符合關于缺血性心臟病的命名和診斷標準，其中45例確診為冠心病，急性心肌梗死(AMI)，23例診斷為冠心病，心絞痛型，12例診斷為冠心病，缺血性心肌病，成功完成基因檢測90人，均為冠狀動脈造影證實冠狀動脈病變患者，男62例，女28例，平均年齡(60.01±12.40)歲。同期100名對照組，成功完成基因檢測79例，男44例，女35例，平均年齡(64.27±11.28)歲，均行冠狀動脈造影術無冠脈病變。

方法：采用基因芯片檢測技術，結合PCR體外擴增方法，檢測人類冠心病相關基因AGT基因235的多態性情況。⑴標本采集采集被檢者靜脈血0.5ml，用一次性無菌注射針頭抽取，收集于含50μl的2%EDTA溶液的無菌1.5ml離心管中，蓋上管蓋，上下顛倒數次使混勻。⑵存放上述血樣在2℃～8℃保存，保存期不應超過3周；在-20℃保存期半年，-80℃可長期保存，但嚴禁反復凍融。⑶采用適用0.2ml擴增管并有熱蓋的PCR擴增儀。⑷在芯片雜交過程中采用溫控精度為±0.5℃的恒溫設備（BaiO FLWS-526全自動雜交儀）進行雜交。⑸在芯片雜交信號檢測時采用BaiO BE-2.0生物芯片識讀儀。圖像Array Docctor軟件分析可自動輸出檢測結果，最后檢測出AGTM235T基因的多態性位點。

質量控制：每次檢測中都應設置陰性、陽性、對照品。產品檢測過程中，若軟件對“標志列、陰性、陽性對照”3者進行判斷后，輸出其中之一為“不合格”，則實驗無效。

結果判斷：由軟件自動判斷并輸出結果，當軟件判斷標志列、陰性、陽性對照均合格時，會自動輸出檢測結果。其中，“+”表示對健康不利的基因純合子，“±”表示基因雜合子，“-”表示對健康有利的基因純合子。

統計學分析：⑴首先應用SPSS11.0軟件包作統計學處理。AGT基因型和等位基因頻率之間的比較用χ2檢驗，同時計算優勢比(OR)及95%可信區間（95%CI）。⑵對所選病例進行多元Logistic回歸統計學分析，以各危險因素（性別、年齡及基因型）為自變量，通過冠脈造影確診為冠心病組、正常對照組為因變量，構建二分類Logistic回歸模型，對各危險因素進行篩選，選擇Backward LR法（后退法，似然比檢驗）建立模型，進入水準為α＝0.05，剔除水準β＝0.10（見表1）。

表1 冠心病的可能危險因素與賦值

結 果

對入選患者進行一般臨床資料分析，病例組和對照組除了在年齡（P＝0.016） 及性別構成（P＝0.003） 的差異有統計學意義，其它指標均無統計學差異（見表2）。

表2 一般臨床資料在兩組中的分布

CHD組與正常對照組A GT基因M235T多態性檢測：CHD組及對照組的基因型頻率適合度檢測，顯示皆達到Hardy-werberg平衡。CHD組AGT-TT基因型頻率(45.9%)與對照組組(28.8%)基因型頻率比較，差異有統計學意義（χ2＝9.87，P＝0.007），TT型基因型與CHD呈正相關。2組T等位基因頻率分別為75%（CHD組）；61%（對照組），差異有統計學意義 （χ2＝6.701P＝0.01 OR＝0.541，CI＝0.339-0.864），見表3。

對性別、年齡及基因型進行多元Logistic回歸：結果，男性患者患冠心病的可能性是女性患者的3.775倍；年齡每增加10歲患冠心病的可能性就增加1.663倍。多攜帶一個T等位基因患冠心病的可能性就增加2.508倍（表4）。

表3 AGT基因M235T型基因型頻率的分布（%）

表4 方程中變量的檢驗情況

討 論

近年來由于研究手段的進步，人們開始對基因多態性等內部因素給予更多地關注，其中AGT基因M235T多態性與CHD的關系倍受重視[5]。國內外研究普遍認為AGT基因多態性可以改變血漿AGT水平[4]，血漿AGT水平隨235T等位基因數量的增加而增加。而血漿AGT的增加又可引起血管緊張素（Ang）Ⅱ水平的過度增高，從而使血壓升高，心臟后負荷增加，導致心肌肥厚。AngⅡ的過度增高還可使內皮功能失調，誘發心肌缺血及粥樣斑塊破裂。也可使低密度脂蛋白在血管壁滯留，氧化及被吞噬細胞吞噬，這些對CHD發生發展都具有促進作用。Katsuya等[5]對422例冠心病患者和406例無冠心病的正常對照組進行了AGT基因M235T多態性的調查，發現AGT基因的T/T基因型頻率在冠心病組顯著高于對照組，經Logistic回歸分析表明，AGT基因的T/T型是冠心病的獨立危險因素。Ishigami等[6]對日本人的AGT基因類型檢測發現冠心患者中T/T基因型頻率為65.9%，顯著高于正常對照組的49.3%。陳德等[7]在上海地區研究結果提示AGT基因M235T變異可使中國人群MI的發病危險性增加。但是也存在一些不同的研究結果，Arnett等的研究結果為AGT基因的M235T變異與動脈粥樣硬化和動脈壁增厚無相關性[8]。此外，AGT基因M235T多態性的各基因型頻率在不同種族人群中的分布有較大差異。T等位基因頻率在白人中一般為0.35～0.45，在日本人中為0.6～0.7，美洲黑人中可達0.84～0.93[4]，中國漢族人群為0.65[9]。O-livieri[10]發現AGT 235T等位基因頻率在亞洲與高加索人群中有相當大的差異，分別為0.63～0.79，0.35～0.41。他從對日本和中國人群研究的結論均有爭議中推斷出，人群中種族的變異也可以導致基因型結果的不同。

本實驗研究結果顯示，CHD人群和正常人群的AG M235T分子變異差異有顯著性。90例CHD患者和79例非冠心病患者AGT基因M235T TT型差異有顯著性，兩組T等位基因頻率差異有統計學意義，提示該人群中AGT基因M235T多態性與CHD發病有關，經多因素Logistic回歸分析表明：T等位基因是CHD發病的危險因素，多攜帶一個T等位基因患冠心病的可能性就增加2.508倍，本研究結論與中國大陸相關報道相似[7]，而與臺灣地區報道有差別[11]，支持Olivieri推斷。男性患者患冠心病的可能性是女性患者的3.775倍；年齡每增加10歲患冠心病的可能性就增加1.663倍。

隨著分子生物學技術的發展，國內外學者越來越多地致力于尋找CHD與某些基因多態性之間的關系，試圖揭示CHD的最終發病機制。不同的結果也許與病例選擇、種族、研究方法都有關系。因此，在今后的研究中應注意候選基因的選擇要有明確的病理生理學基礎；候選基因多態性對其編碼的蛋白質具有功能影響；采用更加合理的檢測方法；正確選擇研究對象，深入研究基因與基因。基因與環境之間的相互作用及基因型與表型的聯系等，對進一步明確多基因相關性疾病具有重要意義。基因芯片技術通過堿基互補配對原理進行雜交，然后通過檢測探針分子雜交信號強度，獲得樣品中大量基因序列及表達的信息，其特點是高效、快速、自動微型化、高通量、高度并行性及高度敏感性，有著廣泛的應用前景。及早對具有冠心病易感基因的人群進行有關健康飲食和生活習慣的宣傳和篩查，將可降低該人群冠心病的發病率和死亡率。而且因病人的遺傳背景不同，將來可能有望根據不同基因型進行冠心病個體化預防、治療和隨訪。

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