椎體成形術后椎體界面骨血管內皮生長因子mRNA表達的實驗研究

趙 剛，胡偵明，舒 鈞，勞漢昌

（1.昆明醫學院第二附屬醫院 急診科創傷骨科組，云南 昆明 650101；2.重慶醫科大學第一附屬醫院 骨科，四川 重慶 400016；3.昆明醫學院第二附屬醫院 骨科，云南 昆明 650101）

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）因其良好的療效及安全性能受到廣泛使用，但PMMA植入體內致骨組織損傷后修復過程至今仍未清楚，骨組織對PMMA植入后的反應尚不清楚，國內外均未見報到。本實驗旨將PMMA骨水泥模仿椎體成形術植入老齡骨質疏松兔腰椎椎體內，觀察骨水泥－骨界面周圍骨組織的形態學改變及炎癥反應情況，用適時定量PCR及蛋白印記技術（Western blot）檢測骨水泥－骨界面周圍骨組織內VEGF mRNA的擴增及蛋白表達情況，擬從細胞及分子水平了解骨質疏松性椎體壓縮骨折行椎體成形術后PMMA骨水泥周圍骨組織的損傷及修復情況，為全面評價PMMA骨水泥對機體的長期影響及轉歸提供一定的理論及實驗室依據。

材料及方法

一、實驗器械及材料 腰椎前路器械、硬膜外穿刺針；骨密度儀(美國LUNAR公司)，PMMAⅢ型復合骨水泥(天津市合成工業材料研究所)；低溫高速離心機(Heraeus)，紫外可見分光光度計(Unico)，Real-time PCR儀(Bio-Rad)， 酶標儀(Tecan).Western Blot試劑:小鼠抗兔VEGF單克隆抗體、山羊抗鼠HRP標記IgG抗體、BCA-100蛋白質定量試劑盒（上海申能博彩生物科技有限公司），其它試劑均為國產分析純以上級別。

二、實驗方法 1.動物分組：老年新西蘭雌兔72只，體重3.1～4.2kg，平均3.7kg（由昆明醫學院實驗動物中心提供），經DXA檢測符合骨質疏松兔標準者采用。術前拍腰椎正側位X線片，顯示正常腰椎序列及骨質結構。72只實驗動物隨機編號，分為實驗組和對照組，再分為術后1h，24h，3d，7d，4w，12w亞組，每亞組各6只。實驗組選擇L2、L4椎體節段植入PMMA骨水泥。各相應對照組只進行手術不植入PMMA，分別于術后1h，24h，3d，7d，4w，12w6個時相段處死動物觀察。

2.動物模型的制備和材料植入：手術步驟：⑴4%戊巴比妥那(1ml/kg)耳緣靜脈注射麻醉；⑵將兔子俯臥固定于操作臺上，定位L7(兩髖最高點連線交界處)，取背部正中切口，顯露L2～L6椎體的前半部分(后半部分外走行脊神經，勿顯露，以防損傷)。由椎弓根中線與橫突前緣連線交點后方1mm處進針，與水平面呈35°～40°夾角，與冠狀面呈0°～5°夾角，進針深度4～6mm。將PMMA調配成可注射的稀糊狀(骨水泥粉∶液為4ml∶1g)裝入1ml注射器內，通過硬膜外穿刺針緩慢注射，邊注射邊拔出穿刺針，注射量約0.5～0.6ml。以上操作每只進行2個椎體，每組完成6只；⑶術后處理，術后7d肌肉注射青霉素100萬U/只，1次/d。手術過程順利，實驗組有1只術后因操作失誤將穿刺針刺入椎管引起癱瘓。術后所有兔子均由本院試驗動物中心專業人員飼養。術中、術后均無死亡。

3.X線檢查：在術后即刻和1h，24h，3d，7d，4w，12w處死動物前，分別攝腰椎側位X線片檢查，觀察植入材料是否在椎體內部，是否脫落和崩裂，觀察植入材料的形態。

4.標本制作：⑴術后1h，24h，3d，7d，4w，12w取椎體檢測；⑵新鮮取出的椎體節段，去除椎體附件，包括附著的肌肉、韌帶、椎弓根、椎板和椎間盤，僅剩椎體，雙層塑料袋密閉后冷藏于-75℃保存備用，測試前取出在室溫下自然解凍。

5.分子生物學操作：⑴配制試劑；⑵RT-PCR；⑶目的基因檢測；⑷Western Blot顯影定影。

研究中所用的引物如下。

6.實驗結果分析：⑴VEGF mRNA RT-PCR擴增結果計算 首先樣品Ct-內參Ct=⊿Ct，以其中一個樣本⊿Ct（通常為對照組）為參照，計算⊿⊿Ct。計算方法為⊿Ct（樣本） -⊿Ct（參照）。最終樣本之間倍數關系為2的-⊿⊿Ct次冪

⑵蛋白表達結果 將X線膠片置于Tanon凝膠圖像處理系統，測定目的條帶的強度和面積，計算蛋白相對含量值，相對含量值＝強度×面積。

7.組織學觀察：在骨組織與材料交界處取材，僅留界面周圍骨組織，鋸成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小，用10%中性福爾馬林液固定，EDTA脫鈣、脫水、透明石蠟包埋，8μm連續切片，HE染色后在光鏡下觀察炎癥反應、骨壞死和新骨形成情況。

結 果

一、X線檢查 所有的填充材料未見脫落、崩裂、松動。術后3個月植入材料與骨交界部位模糊不清，有新骨形成，但材料體積無明顯縮小。對照組，術后及3個月均見實驗椎體有約有0.5大小直徑的圓形低密度區。

二、組織形態學觀察 植入PMMA組術后24h組界面骨組織見明顯炎性細胞浸潤，未見明顯骨組織壞死表現，3d后炎癥反應達高峰，至7d減輕，4w時未見明顯炎性細胞，12w無任何炎癥表現；4w時椎體骨與材料交界處出現軟骨細胞呈團狀生長并向編織骨分化，12w時細胞內成骨明顯，可見大量的板層骨形成，偶爾可見到造血骨髓（見圖1～4）。

三、VEGF RT-PCR擴增及蛋白表達 1.VEGF RT-PCR擴增 以Actin作為內參擴增到分子量為157 bp目的條帶，根據內參推斷，與文獻中擴增到的基因片段一致，說明此即為VEGF的目的條帶（見圖5）。

2.VEGF mRNA擴增結果 PMMA術后1h及24hVEGF的表達減少且低于對照組，有統計學差異（P＜0.05）；而術后3dVEGF的表達明顯增加，至7d時再次降低，低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；4～12wVEGF的表達持續增加，與實驗7d組及相應對照組比，差異有統計學意義（P＜0.01）（見表1）。

3.VEGF蛋白檢測結果 PMMA術后1h及24hVEGF的表達略有升高，而術后3dVEGF的表達明顯增加，至7d時再次降低，而4～12wVEGF的表達明顯增加,差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

討 論

骨損傷后3d在間葉細胞和成骨細胞中可見TGF－β1，2，3，bFGF，FGFR，PDGF的表達[1]，5d VEGF的表達明顯增強，此時軟骨血管內皮中這些物質的表達達峰值，骨折7d后軟骨向骨轉化，骨折后14d出現軟骨內骨化。Steinbrech等[2]的研究發現，在骨折愈合過程中VEGF的表達是上調的；機制為：骨折部位有缺氧；各種細胞在缺氧刺激下表達VEGF；缺氧能通過刺激成骨細胞產生VEGF，缺氧微環境能促進成骨細胞的增殖、分化。但過度嚴重的缺氧也會減少細胞的增殖，細胞抗原分化減少，相應的VEGF表達下調，從而認為VEGF在骨折愈合及軟骨內骨化中起到了關鍵作用。VEGF的表達，一定程度上可引起血管新生從而引導血流至骨折端，促進骨折愈合。Komatsu[3,4]的研究表明，在骨折愈合的過程中均有VEGF的表達。骨折局部氧濃度的大小作為刺激原激活缺氧誘導因子（Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1），刺激成骨細胞產生VEGF，在骨折的3～10d內VEGF的表達即達到高峰，骨小梁內可見VEGF的表達增高。Li[5]的研究表明，許多細胞因子最終是通過激活VEGF或使其表達上調而促進骨折愈合。Hu[6]的研究表明，骨形態發生蛋白能增強VEGF及Ⅰ型膠原的活性而促進骨折愈合，VEGF亦能增強BMP的作用，促進骨礦化，但VEGF的含量過高會降低二者的協同作用。Chua[7]等離體加入TGF后2h即可見VEGF的表達增強，當一定量離子輻射損害細胞分泌水平使TGF減少，破骨細胞增殖加速使VEGF的表達減少，骨折愈合延遲，表明TGF促進骨骼生長的作用是通過增強成骨細胞表達VEGF來實現的[8～10]。當機體發生感染后，如膿毒血癥、骨髓炎等，能致VEGF mRNA表達降低，使VEGF合成減少，致感染時骨折延遲愈合甚至不愈合[11]。VEGF是在成骨細胞、巨噬細胞、成纖維細胞內產生合成，然后以自分泌或旁分泌的方式分別參予骨礦化和血管新生作用[5]。該類細胞所處的細胞外微環境對VEGF的產生有非常顯著的影響。微環境中的PH及乳酸濃度能對VEGF的表達產生獨立的影響。VEGF產生的最佳微環境為機體的中性環境（即pH=7.35～7.45，平均7.40） 最佳，當pH值為7.0時，VEGF的表達明顯減少，而乳酸濃度增高時亦能抑制成骨細胞VEGF的表達[12]。國內的研究表明[13]，VFGF表達量在傷后不同時相不盡相同，骨折后8h其表達己達到較高的水平，在24h有所降低，之后迅速回升，并在骨折后72h－3周維持在高表達狀態，5－8周表達連續降低。早期的研究表明[14,15]，PMMA對培養細胞的毒性主要是引起成骨細胞壞死，是通過PMMA單體釋放羥自由基引起過氧化反應造成細胞損傷。PMMA單體自由基可使骨－水泥界面處的巨噬細胞釋放花生四烯酸，并可使局部組織細胞產生釋放乳酸脫氫酶增多，產生類似肉芽腫性炎癥反應引起組織損傷。我們的研究結果顯示：PMMA術后1h及24h VEGF的表達減少且低于對照組，而術后3dVEGF的表達明顯增加，至7d時再次降低，而4～12w VEGF的表達明顯增加。24h組的降低可能與PMMA凝固時的放熱反應及單體自由基的氧化反應改變細胞的微環境抑制了成骨細胞活性，致VEGF的表達減少；至3d時由于炎癥反應明顯增強，炎性細胞如巨噬細胞、成纖維細胞等表達VEGF而出現VEGF高峰，7d隨著炎癥反應的消退，炎性細胞減少，VEGF的表達減弱。隨著氧自由基的減少和熱反應損傷的修復，細胞微環境恢復，成骨細胞活性正常，4w后可見VEGF的高表達，至12wVEGF表達降低，HE染色見骨組織修復完成，此時主要為破骨細胞釋放VEGF。從我們的實驗結果可以發現：PVP術后PMMA骨水泥對周圍骨組織的損傷修復有一定影響，主要表現為時間延遲，但并未造成不可逆的缺血損傷。修復機制與正常骨折愈合是相似的，結果也無明顯區別，但時間比正常愈合進程延遲4W左右。PVP術后骨水泥－骨界面周圍骨組織的細胞微環境改變有待進一步研究。

表1 VEGF mRNA經 RT-PCR 擴增⊿⊿Ct值 （s,n＝6）

表1 VEGF mRNA經 RT-PCR 擴增⊿⊿Ct值 （s,n＝6）

注：*VS相應對照，P＜0.05；＃VS對照 7d組，P＜0.05；▼VS實驗 7d組，P＜0.001。

表2 VEGF蛋白表達檢測結果（s,n＝6）

表2 VEGF蛋白表達檢測結果（s,n＝6）

注：*VS相應對照，P＜0.05。

［1］VLADIMIROVBS,DIMITROVSA.Growth factors-importance and possibilities for enhancement of the healing process in bone fractures[J].Folia Med(Plovdiv),2004,46(2):11-17.

［2］STEINBRECH DS,MEHRARABJ,SAADEH PB,et al.Hypoxia regulates VEGF expression and cellular proliferation by osteoblasts in vitro[J].Plast Reconstr Surg,1999,104(3):738-347.

［3］KOMATSU DE,HADJIARGYROU M.Activation of the transcription factor HIF-1 and its target genes,VEGF,HO-1,iNOS,duringfracture repair[J].Bone,2004,34(4):680-688.

［4］HARRYLE,PALEOLOGEM.Fromthe cradle tothe clinic:VEGF in developmental,physiological,and pathological angiogenesis[J].Birth Defects Res C Embryo Today,2003,69(4):363-374.

［5］LI G,CUI Y,MCILMURRAYL,ALLENWE,et al.rhBMP-2,rhVEGF(165),rhPTN and thrombin-related peptide,TP508 induce chemotaxis of human osteoblastsand microvascular endothelial cells[J].J Orthop Res,2005,23(3):680-685.

［6］HU Z,PEELSA,HO SK,et al.Role ofbovine bone morphogenetic proteins in bone matrix protein and osteoblast-related gene expression during rat bone marrow stromal cell differentiation[J].J Craniofac Surg,2005,16(6):1006-1014.

［7］PENGH,USASA,OLSHANSKI A,et al.VEGF improves,whereas sFlt1 inhibits,BMP2-induced bone formation and bone healing through modulation of angiogenesis[J].J Bone Miner Res,2005,20(11):2017-2027.

［8］CHUACC,HAMDYRC,CHUABH.Mechanismoftransforming growth factor-beta1-induced expression of vascular endothelial growth factor in murine osteoblastic MC3T3-E1 cells[J].BiochimBiophys Acta,2000，1497(1):69-76.

［9］SAADEH PB,MEHRARA BJ,STEINBRECH DS,et al.Transforming growth factor-beta1 modulates the expression of vascular endothelial growth factor by osteoblasts[J].Am J Physiol,1999，277(4 Pt 1):C628-637.

［10］WANGFS,KUOYR,WANGCJ,et al.Nitric oxide mediates ultrasound-induced hypoxia-inducible factor-1alpha activation and vascular endothelial growth factor-A expression in human osteoblasts[J].Bone,2004,35(1):114-123.

［11］KHODAPARAST O,COBERLY DM,MATHEY J,et al.Effect of a transpositional muscle flap on VEGF mRNA expression in a canine fracture model[J].Plast Reconstr Surg,2003,112(1):171-176.

［12］SPECTOR JA,MEHRARA BJ,GREENWALD JA,et al.Osteoblast expression of vascular endothelial growth factor is modulated by the extracellular microenvironment[J].Am J Physiol Cell Physiol,2001，280(1):C72-80.

［13］初同偉，王正國，朱佩芳.骨折愈合過程中血管內皮生長因子基因擴增及蛋白表達研究[J].中華實驗外科雜志，2002，19（4）：367-368.

［14］KENNEDY JG,O'GRADY P,MCCARTHY DR,et al.An investigation into the role of oxygen free radical scavengers in preventing polymethylmethacrylate-induced necrosis in an osteoblast cell culture[J].Orthopedics,2000，23(5):481-485.

［15］HOROWITZ SM,GAUTSCH TL,FRONDOZA CG,et al.rMacrophage exposure to polymethyl methacrylate leads to mediator release and injury[J].J Orthop Res,1991，9(3):406-413.