雷氏大疣蛛毒素組分13對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用

靳 祎， 王恩軍， 郭曉軍， 袁洪水， 朱寶成

(1.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北保定071000;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001)

蜘蛛毒素是由神經(jīng)毒性肽、蛋白質(zhì)和低分子量物質(zhì)所構(gòu)成的復(fù)雜混合物，具有多種活性［1-2］。雷氏大疣蛛Macrothele raveni是最近發(fā)現(xiàn)的一種異仿科大疣蛛屬蜘蛛新種［3］。有報(bào)道它可以抑制人肝癌BEL-7402、HepG2細(xì)胞和宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖，主要是細(xì)胞周期相關(guān)基因c-myc表達(dá)減弱以及誘導(dǎo)p21基因的表達(dá)［4-6］。有關(guān)蜘蛛毒素抗腫瘤活性蛋白的分離純化方面的研究，國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。對(duì)此，本實(shí)驗(yàn)采用反相層析法對(duì)雷氏大疣蛛毒素進(jìn)行了分離純化，收集到13個(gè)組分，通過(guò)采用MTT法檢測(cè)各蛋白組分的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的組分4個(gè)，其中組分13的抑制作用較強(qiáng)，而且峰型較單一，適宜做進(jìn)一步分離純化。本實(shí)驗(yàn)就此組分對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行了研究，為雷氏大疣蛛毒素作為新型抗腫瘤藥物的深入研究及臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 人宮頸癌細(xì)胞株Hela 由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。

1.1.2 試劑 雷氏大疣蛛毒素干粉購(gòu)自廣西南寧南方蜘蛛養(yǎng)殖研究所;胎牛血清購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所;RPMI-1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司;順鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自Sigma公司;考馬斯亮藍(lán)R-250染液購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Hela細(xì)胞的培養(yǎng) 接種宮頸癌Hela細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，每周傳代2次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2.2 雷氏大疣蛛毒素組分13的分離 將雷氏大疣蛛毒素粉末溶于雙蒸水，質(zhì)量濃度為50 mg/mL，14000 r/min離心10 min，取上清液，0.45 μm 濾膜過(guò)濾。將樣品上樣于AKTA explorer 100型蛋白液相色譜儀，采用反相層析法進(jìn)行分離純化，分步收集各個(gè)組分，將組分13置于超低溫冰箱中直至成固態(tài)后，再放置于冷凍干燥機(jī)中，抽真空濃縮，直至樣品完全干燥，置于-20℃冰箱保存。

1.2.3 MTT法檢測(cè)各分離組分的抗癌活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，胰酶消化后充分吹打混勻成單細(xì)胞懸液，用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)，制成2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，加入96孔板中，每孔加入200μL。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分3組，空白對(duì)照組加生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組加順鉑(質(zhì)量濃度為20μg/mL)，實(shí)驗(yàn)組加入不同質(zhì)量濃度(分別為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL)的毒素分離組分，每個(gè)劑量6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，取出培養(yǎng)板每孔加入5 μg/μL的MTT液(RPMI1640培養(yǎng)基配制)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4h，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入 DMSO 150μL，震蕩15 min，充分溶解結(jié)晶顆粒，于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值(A值)，測(cè)定波長(zhǎng)λ=570 nm，參考波長(zhǎng)λ=630 nm，計(jì)算各分離組分對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制率(Grow inhibitory rate，GIR)，并計(jì)算活性蛋白組分對(duì)Hela細(xì)胞半抑制率(IC50)。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

增殖細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值 /空白對(duì)照組A值)×100%

1.2.4 形態(tài)學(xué)變化 待Hela細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以1×105/孔的密度接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中24 h，實(shí)驗(yàn)組加入含20 μg/mL組分13的RPMI-1640培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含生理鹽水的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變并攝片。

1.2.5 活性組分的SDS-PAGE電泳 采用SDS-PAGE檢測(cè)抗癌活性蛋白組分的純度和分子質(zhì)量。分離膠濃度12%，pH8.8，濃縮膠濃度為 4%，pH 6.8，加速劑 N，N，N，N ˊ-四甲基乙二胺(TEMED)10μL，助凝劑10%過(guò)硫酸銨(APS)50μL，并且點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白。電泳結(jié)束后，取出凝膠并作標(biāo)志，將凝膠放入染色盤中。加入考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色，37℃保溫染色30 min。倒出染色液，用蒸餾水洗膠板數(shù)次后加入乙酸、乙醇混合溶液脫色。反復(fù)漂洗，直至背景清晰為止，檢測(cè)樣品的分子量及成分純度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用The SAS system 6.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 組分13對(duì)Hela細(xì)胞抑制作用的量效和時(shí)效關(guān)系 不同濃度的雷氏大疣蛛毒素組分13作用于體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞48h后，MTT結(jié)果顯示組分13對(duì)Hela細(xì)胞具有顯著的抑制作用，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，A值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其抑制率隨濃度的降低有所下降，在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性，量效關(guān)系良好(見表1)。

表1 雷氏大疣蛛毒素組分13對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用

Hela細(xì)胞經(jīng)雷氏大疣蛛毒素組分13作用于24、48、72 h后，結(jié)果表明細(xì)胞一直處于被抑制狀態(tài)，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用明顯增強(qiáng)，時(shí)效關(guān)系良好(見表2)。

表2 雷氏大疣蛛毒素組分13不同作用時(shí)間對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率

2.2 組分13對(duì)Hela細(xì)胞的IC50通過(guò)MTT法作出的Hela細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以得到雷氏大疣蛛毒素組分13抑制細(xì)胞生長(zhǎng)50%時(shí)的質(zhì)量濃度為24 μg/mL(48 h)。

2.3 組分13的SDS-PAGE電泳 見圖1。對(duì)組分13進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，組分13顯示出兩個(gè)高分子量條帶，分子量在大約80KDa左右。

2.4 形態(tài)學(xué)觀察 正常宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)良好，密度較大，部分重疊成簇，細(xì)胞為長(zhǎng)梭形或多角形，隱約可見胞核圓形，位于中央，排列不規(guī)則，細(xì)胞界限清晰，培養(yǎng)液中僅見少許漂浮的細(xì)胞;Hela細(xì)胞經(jīng)組分13處理后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞逐漸變?yōu)閳A形，體積縮小，胞膜皺縮，細(xì)胞間連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，培養(yǎng)液中有許多漂浮的呈桑葚樣細(xì)胞，碎片較多。

圖1 雷氏大疣蛛毒素組分13的SDS-PAGE電泳圖譜

3討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國(guó)家排行榜首。中西醫(yī)綜合治療癌腫是我國(guó)腫瘤研究的成就，中醫(yī)中藥治癌副作用小，減輕患者放療、化療的毒副反應(yīng)，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生命，降低癌癥的死亡率。因此新型抗癌藥物的研發(fā)倍受人們關(guān)注。

蜘蛛毒素在抗癌方面的研究已經(jīng)證實(shí)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用［4-8］，因此在新型抗腫瘤藥物的研究方面顯示出廣闊的開發(fā)前景。本試驗(yàn)使用人宮頸癌Hela細(xì)胞作為腫瘤細(xì)胞模型，采用反相層析法對(duì)雷氏大疣蛛毒素進(jìn)行了初步分離，并檢測(cè)了各蛋白組分抗癌活性。其中組分13對(duì)Hela細(xì)胞呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗癌活性，顯示較好的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。另外，SDS-PAGE電泳表明組分13是由分子量在80KDa左右的蛋白組成，為下一步蛋白的繼續(xù)分離純化及新型抗腫瘤藥物的開發(fā)和研制奠定理論基礎(chǔ)。

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