正交試驗比較金銀花藥材中綠原酸與木犀草苷的乙醇提取工藝

閔春艷， 游本剛， 許瓊明， 李笑然， 唐麗華， 楊世林

(1.蘇州藥品檢驗所，江蘇蘇州215002;2.蘇州大學醫學部藥學院，江蘇 蘇州215213)

金銀花系忍冬科植物忍冬Lonicerae japonicae Thunb的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、涼風散熱之功效［1］。主要成分為有機酸類、黃酮類、揮發油類和皂苷類等［2-3］，其中，木犀草苷是金銀花用以區別山銀花的特征性成分，也是其主要藥效成分之一。因此，在原有綠原酸質量控制標準的基礎上，新增了木犀草苷作為2005年版、2010年版《中國藥典》金銀花質量控制指標［4-5］。多年以來，在金銀花藥材的提取工藝及提取物質量標準研究中，均是以綠原酸為質控指標，而木犀草苷卻未引起足夠的重視［6-7］。本研究建立了HPLC法同時測定金銀花提取物中綠原酸與木犀草苷的方法，同時以兩種成分為指標，通過正交試驗設計優化并比較了金銀花藥材的乙醇提取工藝。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(配備SPD-M20A型二極管陣列檢測器，LC-20AT型泵，CTO-10ASVP型溫控柱溫箱，LC solution型色譜工作站，日本島津儀器公司);AS20500AT超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);電子分析天平(賽多利斯)。

綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110753-200413);木犀草苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，111720-200501);金銀花藥材(蘇州市天靈中藥飲片有限公司，批號071211-1);乙腈(色譜純，TEDIA公司);四氫呋喃(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司);其余試劑均為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 綠原酸和木犀草苷的測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品10.18 mg，置50 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，制得質量濃度為203.6 μg/mL的綠原酸貯備液。

精密稱取木犀草苷對照品10.06 mg，置50 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，制得質量濃度為201.2 μg/mL的木犀草苷貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取金銀花提取物樣品約20 mg，置10 mL量瓶內，加入50%甲醇溶解、定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.3 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);以乙腈-四氫呋喃(95 ∶5)為流動相 A，0.4% 磷酸為流動相B，采用梯度洗脫:0～8 min，88%B;8～10 min，80%B;10～25 min，80%B～75%B;綠原酸和木犀草苷的檢測波長分別為327 nm和350 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫 35 ℃;進樣量20 μL。

分別取混合對照品溶液及供試品溶液，適當稀釋后采用上述色譜條件進樣，記錄色譜圖，結果見圖1。

圖1 金銀花供試液在350 nm(A)和327 nm(B)的液相色譜圖及對照品溶液在350 nm(C)和327 nm(D)的液相色譜圖

2.1.4 線性關系 精密量取上述兩種貯備液適量，用50%甲醇稀釋，分別得質量濃度為 10.18、20.36、40.72、81.44、122.16、162.88 μg/mL 的綠原酸系列對照品溶液和質量濃度為 2.012、4.024、8.048、12.072、16.096、20.12 μg/mL 的木犀草苷系列對照品溶液，按2.1.3項下色譜條件進樣，以對照品質量濃度C對峰面積A進行線性回歸，得綠原酸的標準曲線方程為 A=58026C-120395(r=0.9999)，線性范圍為10.18 ～162.88 μg/mL;木犀草苷的標準曲線方程為A=55898C-49443(r=0.9997)，線性范圍為2.01 ～20.12 μg/mL。

2.1.5 精密度實驗 精密吸取標準溶液20 μL，在一天內連續進樣測定5次，以及連續5 d進樣測定，計算得綠原酸和木犀草苷的日內RSD分別為1.32%和1.79%，日間RSD分別為 1.74%和 2.33%。

2.1.6 回收率實驗 精密稱取已知綠原酸和木犀草苷量的提取物樣品適量，置10 mL量瓶內，分別精密加入相當于已知對照品量80%、100%、120%的綠原酸、木犀草苷對照品，加入50%甲醇溶解、搖勻，濾過。將續濾液適當稀釋后HPLC進樣測定綠原酸和木犀草苷的量，計算得綠原酸和木犀草苷的平均回收率分別為103.29%和102.18%，RSD分別為 1.21%和 1.99%。

2.2 乙醇回流提取法 準確稱取干燥的金銀花藥材50 g，加入一定量的乙醇，浸泡0.5 h后，選用L9(34)正交表進行試驗，因素與水平見表1。藥材回流提取2次后，合并每次實驗的金銀花提取液，過濾后減壓濃縮、真空干燥后進行HPLC測定，計算綠原酸與木犀草苷的轉移率，結果見表2。

表1 因素水平

表2 正交試驗安排及結果

以綠原酸轉移率為指標直觀分析(見表3)，影響因素順序為A＞B＞C，即含乙醇量＞乙醇用量＞回流時間;最佳工藝為A1B1C1，即60%乙醇8倍量，回流提取2次，每次0.5 h。方差分析結果表明3個因素對綠原酸的提取效果均無顯著性影響。

表3 綠原酸轉移率直觀分析

以木犀草苷轉移率為指標直觀分析(見表4)，影響因素順序為C＞A＞B，即回流時間＞含乙醇量＞乙醇用量;最佳工藝為A1B2C1，即60%乙醇10倍量，回流提取2次，每次0.5 h。方差分析結果表明3個因素對木犀草苷的提取效果均無顯著性影響(P＞0.05)。

為兼顧綠原酸和木犀草苷的提取效果，結合兩者的轉移率計算，總轉移率評分=綠原酸轉移率/最高值×50+木犀草苷轉移率/最高值×50，以總轉移率評分為指標來對正交試驗結果進行分析(見表5)，則影響因素順序為C＞A＞B，即回流時間＞含乙醇量＞乙醇用量;最佳工藝為A1B1C1，即60%乙醇8倍量，回流提取2次，每次0.5h。方差分析結果表明3個因素對兩成分的總提取效果均無顯著性影響(P＞0.05)。

表4 木犀草苷轉移率直觀分析

表5 總轉移率評分直觀分析

2.3 乙醇超聲提取法 準確稱取干燥的金銀花藥材50 g，加入一定量的乙醇，浸泡0.5 h后，選用L9(34)正交表進行試驗，因素與水平表見表6。藥材提取后，合并每次實驗的金銀花提取液，過濾后減壓濃縮、真空干燥后進行HPLC測定，計算綠原酸與木犀草苷的轉移率，結果見表7。

以綠原酸轉移率為指標直觀分析(見表8)，影響因素順序為A＞B＞D＞C，即含乙醇量＞超聲功率＞超聲時間＞乙醇用量;最佳工藝為A1B2C3D2，即60%乙醇12倍量，超聲功率240W，超聲1.0h。以離差平方和最小的因素項(C項)為誤差項進行方差分析，結果表明A、B、D 3個因素對綠原酸的提取效果均無顯著性影響(P＞0.05)。

表6 因素水平表

表7 正交試驗安排及結果

以木犀草苷轉移率為指標直觀分析(見表9)，影響因素順序為B＞A＞D＞C，即超聲功率＞含乙醇量＞超聲時間＞乙醇用量;最佳工藝為A1B2C1D2，即60%乙醇8倍量，超聲功率240W，超聲1.0h。以離差平方和最小的因素項(C項)為誤差項進行方差分析，結果表明A、B、D 3個因素對木犀草苷的提取效果均無顯著性影響(P＞0.05)。

表8 綠原酸轉移率直觀分析

表9 木犀草苷轉移率直觀分析

以總轉移率評分為指標直觀分析(見表10)，影響因素順序為B＞A＞D＞C，即含乙醇量＞超聲功率＞超聲時間＞乙醇用量;最佳工藝為A1B2C3D2，即60%乙醇12倍量，超聲功率240 W，超聲1.0 h。以離差平方和最小的因素項(C項)為誤差項進行方差分析，結果表明A、B、D 3個因素對兩者的總提取效果均無顯著性影響(P＞0.05)。

表10 總轉移率評分直觀分析

2.4 不同工藝的比較 準確稱取干燥的金銀花藥材50 g，按上述兩種提取方法的最佳工藝進行提取，制備樣品并進行HPLC測定，計算綠原酸與木犀草苷的轉移率，結果見表11。

表11 幾種最佳工藝提取效果的比較(n=3)

由上表可見，以綠原酸轉移率為指標，乙醇回流法顯著優于超聲法;若以木犀草苷轉移率為指標，則超聲法略優于回流法。同一提取方法，評價指標不同，得到的最佳工藝也有差異，對兩種成分的提取效果略有不同。但以總轉移率評分為指標綜合評價的結果與以綠原酸轉移率為指標一致。

3 討論

本研究建立的HPLC方法可用于金銀花中綠原酸和木犀草苷的同時測定，且含量均符合《中國藥典》的要求，是對《中國藥典》方法的一個補充。

木犀草苷是金銀花用以區別山銀花的特征性成分，具有很強的抗呼吸道合胞體病毒活性，也是其抗菌抗病毒有效成分之一［8］。因此，在金銀花的提取工藝研究中，不能僅以單一成分為指標進行評價，否則不能反映兩種甚至多種成分的綜合提取效果，應結合藥理學研究結果，選擇合理的指標性成分，才能充分保證提取工藝的可行性和提取物的藥效［9-10］。

實驗結果表明，以綠原酸轉移率為指標，回流法顯著優于超聲法;以木犀草苷轉移率為指標，則超聲法略優于煎煮法。綜合指標評價結果與以綠原酸為指標一致，可能與木犀草苷的提取轉移率偏低，對總轉移率評分的貢獻相對較小有關。另外，本研究中測定的是固體提取物中有效成分的轉移率，木犀草苷的轉移率偏低且遠低于在提取液中的轉移率，可能與其濃縮干燥過程中的穩定性有關。如何增加木犀草苷的提取率及改善其穩定性，充分保證金銀花提取物的質量，還有待進一步研究。

［1］王天志，李永梅.金銀花的研究進展［J］.華西藥學雜志，2000，15(4):292-298.

［2］Li Xiaoqin，Sun Xiaohong，Cai Shuang，et al.Investigation on the chemical constituents and variation of the flower buds of Lonicera species by UPLC-ESI-MS/MS and principle component ana lysis［J］.Acta Pharm Sin.2009，44(8):895-904.

［3］Chai Xingyun，Li Songlin，Li Ping.Quality evaluation of Flos Lonicerae through a simultaneous determination of seven saponins by HPLC with ELSD［J］.J Chromatogr A，2005，1070(1-2):43-48.

［4］國家藥典委員會.中化人民共和國藥典:2005年版一部［S］.北京:化學工業出版社，2005:152-153.

［5］國家藥典委員會.中化人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:205-206.

［6］劉祥蘭，劉重芳，張 英，等.金銀花中綠原酸提取工藝的比較和優化研究［J］.中成藥，2000，22(6):402-404.

［7］梁 丹，歐陽小光，熊萬娜，等.星點設計-效應面法優選金銀花中綠原酸回流提取工藝［J］.廣西中醫學院學報，2006，9(4):58-60.

［8］馬雙成，劉 燕，畢培曦，等.金銀花藥材中抗呼吸道病毒感染的黃酮類成分的定量研究［J］.藥物分析雜志，2006，26(4):426-430.

［9］何顯忠，蘭榮德.金銀花的藥理作用與臨床應用［J］.時珍國醫國藥，2004，15(12):865-867.

［10］黃喜茹，劉偉娜，曹 冬.金銀花的化學成分藥理作用研究評析［J］.中醫藥學刊，2005，23(3):418-419.