腦膠質瘤患者血清中基質金屬蛋白酶－2含量的動態研究

向 暉，劉健民，楊小蘭，孫 衛，張建中，萬登峰，何錦華，梁愛軍，冷景興，周 超，古金海

（江西省人民醫院神經外科，南昌330006）

腦膠質瘤是神經外科最常見的惡性腫瘤，腫瘤的侵襲和轉移往往是患者腫瘤復發，預后不良的重要原因。定期影像學（CT、MRI）復查是目前監測病程，選擇治療方案的主要手段。近年來發現基質金屬蛋白酶－2（MMP－2）與腫瘤的侵襲性密切相關，且發現腦膠質瘤患者血清中MMP－2的含量明顯高于正常人。本研究通過動態監測腦膠質瘤患者術前及術后不同時期血清MMP－2的含量，結合同期影像學檢查，研究在腦膠質瘤病程演變過程中MMP－2的變化，為臨床上對腦膠質瘤患者適時選擇適當的治療方案提供依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本組30例均為2006年5月至2008年9月在江西省人民醫院行手術切除的腦膠質瘤患者，按照Kernohan分類法將腦膠質瘤分為Ⅰ－Ⅳ級，其中Ⅰ－Ⅱ級10例，Ⅲ級10例，Ⅳ級10例。30例中男19例，女11例，年齡14～70歲，平均55.3歲。

1.2 血清標本采集

每位患者均于術后3、6、12個月復查頭部平掃及增強 MRI，同時采血。清晨采集空腹靜脈血5mL，2 000r·min－1離心10min，取血清于－4℃保存。

1.3 血清MMP－2的含量測定

采用明膠酶譜測定法。血清標本經1∶200稀釋，上樣20μL置于含0.1%明膠的8%聚丙烯酰胺凝膠中進行SDS－PAGE電泳。電泳結束后，將凝膠置于洗脫液中震蕩洗脫2次，每次45min；然后用漂洗液漂洗2次，每次20min。接著，將凝膠置于孵育液中孵育42h。孵育結束后經染色液染色3h，脫色液 A、B、C 分別脫色0.5、1、2h后顯示出MMP－2為位于藍色背景上的透亮帶。此凝膠經2038Image System成像并以反轉模式打印，使酶解活性表現為白色背景上的黑色條帶，經圖像分析系統讀取條帶面積和灰度。條帶酶解量＝條帶面積×（條帶灰度－背景灰度），以比活［比活＝酶解量÷樣品蛋白濃度，單位：灰度面積（s）·g－1·L－1］反映酶的含量。蛋白質濃度測定用改良lowerys法。

1.4 免疫印跡法定性

SDS－PAGE凝膠取下后放于轉移緩沖液中平衡20min，將與其同等大小的硝酸纖維素（NC）膜濾紙浸濕。依次加上濾紙、NC膜、凝膠、濾紙，轉移1.5h，取出 NC膜加入0.2%麗春紅染液5～10min，顯色后標注好蛋白質相對分子質量標準的位置，去離子水沖至色退。5mL封閉緩沖液封閉1～2h。加入含一抗（羊抗人 MMP－2抗體，美國R＆D公司產品）緩沖液，4℃孵育2～4h，用PBS緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。加入含兔抗羊IgG－HRP緩沖液（pH 7.5），室溫孵育1h，TBS緩沖液洗滌3次，每次10min。加入底物溶液顯色至出現棕色反應帶，立即取出置于PBS溶液中清洗保存。

1.5 統計學方法

數據處理用SPSS10.0統計軟件，組間差異用one－way ANOVA法，兩兩比較用SNK法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清MMP－2含量檢測結果

腦膠質瘤患者不同分級術前術后血清MMP－2含量比較見表1。表1結果顯示：Ⅲ、Ⅳ級腦膠質瘤患者術前術后血清MMP－2含量均顯著高于Ⅰ－Ⅱ級患者血清 MMP－2含量（P＜0.01）；而與術前相比，各級腦膠質瘤患者血清MMP－2含量術后均明顯降低（P＜0.01）。術后12個月行 MRI檢查，Ⅰ－Ⅲ級無復發病例，Ⅳ級復發7例，血清MMP－2含量為（276±21）s·g－1·L－1，較未復發3例（35±4）s·g－1·L－1明顯升高（P＜0.01）。

表1 不同時間患者血清MMP－2含量，s·g－1·L－1

表1 不同時間患者血清MMP－2含量，s·g－1·L－1

分級 n 術前 術后3個月 6個月 12個月Ⅰ－Ⅱ級 10 55±18 9±3△ 9±4△ 10±4△Ⅲ級 10 253±56＊ 82±7＊△ 23±4＊△ 20±2＊△Ⅳ級 10 356±65＊ 98±29＊△ 56±24＊△ 204±18＊△＊P＜0.01與Ⅰ－Ⅱ級比較；△P＜0.01與術前比較。

2.2 免疫印跡法結果

含MMP－2的血清樣本經SDS－PAGE電泳后進行 Western blot分析，MMP－2可被抗 MMP－2單克隆抗體所識別而發生顯色反應，在相對分子質量約72 000處有一條帶；而陰性對照與該抗體無顯色反應。這證實血清樣本中確實含有MMP－2，相對分子質量為72 000。

3 討論

腦膠質瘤侵襲性生長和術后復發是臨床治療療效差和患者死亡的主要原因之一?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）因能降解結締組織及細胞外基質大分子導致腫瘤浸潤及轉移過程而引起了廣泛的關注。MMPs是一類Zn2＋依賴性內肽酶，具有降解各種細胞外基質成分的作用，在正常組織器官發育、創傷愈合新生血管形成、骨的生成與重塑、巨噬細胞游走及軸突生長等生理過程中發揮重要作用。

近年來對MMPs的研究日漸深入。MMPs家族成員均具備以下幾個基本特點：1）每一種酶至少能降解一種ECM成分；2）均以酶原的形式分泌到ECM中，在一定的條件下被激活而發揮作用；3）其活化需要Zn2＋和Ca2＋的參與，以發揮蛋白水解酶的活性。惡性腫瘤在侵襲過程中，必須首先黏附到ECM，繼而靠蛋白水解酶降解ECM，然后瘤細胞在動力因子的作用下向被蛋白酶降解的基質區域移動［1］。在降解 ECM 的多種蛋白水解酶中 MMPs起最主要的作用。MMPs由于能降解細胞外基質的主要成分ì型膠原，而被認為與腫瘤的浸潤轉移和預后密切相關［2］。其中 MMP－2是人體內分布最廣泛的一類蛋白水解酶，且其作用底物也最廣，MMP－2參與正常及病理情況下的細胞外基質重塑、血管發生以及細胞遷移。

在正常穩定狀態下，腦組織中極少有 MMP－2的表達，在炎性細胞、激素、生長因子刺激下細胞轉化過程中其表達數量升高。MMP－2在瘤細胞中表達明顯，主要與腦膠質瘤的侵襲性和血管生成有關，尤其在高級別腦膠質瘤內呈高表達，與腦膠質瘤的惡性程度密切相關［3］。MMP－2水平的增加可作某些腫瘤侵入組織、轉移的標志［4－5］。具有侵襲能力的膠質瘤細胞系分泌大量的MMP－2，同時其侵襲力與MMP－2表達水平存在密切關系［6－7］。

應用Northern印跡和免疫組化技術對臨床組織標本檢測表明，腦膠質細胞瘤中存在 MMP－2的轉錄和表達，并隨膠質瘤惡性程度的增高，其轉錄和表達水平亦明顯增加。明膠酶譜分析顯示，在不同級別的膠質細胞瘤中均存在 MMP－2的前體，而隨著腫瘤惡性程度的增加，活化形式的 MMP－2也隨之增加［8－10］。

本研究通過測定不同級別膠質瘤患者血清中MMP－2含量證實，血清中MMP－2的含量與腫瘤的惡性程度相關，隨惡性程度的增高而增加，腫瘤復發患者血清中 MMP－2含量亦增高。血清MMP－2含量能否作為腫瘤預后判斷與腫瘤復發的診斷指標還存在2個問題，第一是檢測方法繁瑣，準確性相對較差；第二是沒有大樣本統計證實，無法確定臨界值。

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