香附不同炮制品HPLC指紋圖譜研究

徐 媛 ，張文娟 ，王慶偉 ，劉新友 ，程 敏

1.第四軍醫大學唐都醫院藥劑科，陜西 西安 710038；2.陜西商洛學院生物醫藥工程系，陜西 商洛 726000

香附來源于莎草科植物莎草（Cyperus Rotundus L.）的干燥根莖，性辛，味微苦、微甘，性平，歸肝、脾、三焦經，是臨床常用中藥，具有疏肝理氣、調經止痛之功效[1]。其炮制方法多樣，用途極其廣泛。筆者采用指紋圖譜研究的方法，對香附及經不同方法（醋炙、酒炙、炒炭）炮制后的香附炮制品的化學成分變化作了初步研究，發現香附經不同方法炮制后，化學成分存在很大差異。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（島津SPD-10AvP）；超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器廠）；電子分析天平（BS 223S賽多利斯）；粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司，型號：FW200）；電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：98-1-B）。

甲醇（天津市紅巖化學試劑廠，分析純）；流動相所用甲醇為色譜純（美國FISHER公司）；水為純化水；α-香附酮對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110748-201010，含量測定用）；香附藥材（購于西安中藥飲片廠，產地陜西產關中，經第四軍醫大學藥學院生藥教研室王四旺教授鑒定為莎草科植物莎草的根莖，批號：20100501）。

2 方法與結果

2.1 測定方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS-2（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（0～5 min，甲醇比例為 10%～50%；6～50 min，甲醇比例為51%～100%），二元梯度洗脫；檢測波長：254nm；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；記錄時間：60 min。

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取α-香附酮對照品適量，用甲醇制成0.02 mg/ml的溶液。

2.1.2 供試品溶液制備

取待測樣品30 g，加甲醇80 ml，超聲提取30 min，放至室溫后甲醇定容至100 ml，搖勻，靜置后濾過，取續濾液即得。

2.1.3 檢測法

分別吸取上述對照品溶液、供試品溶液各10 μl注入高效液相色譜儀。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、6、12、24 h進樣，測定色譜圖，對主要峰峰面積進行比較，結果各時間點測定色譜圖保留時間穩定，主要峰峰面積相對RSD為1.25%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.4.2 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續進樣6次，測定色譜圖，對主要峰峰面積進行比較，結果6次測定色譜圖保留時間穩定，主要峰峰面積相對RSD為0.72%，精密度良好，符合規定。

2.1.4.3 重現性試驗 取同一批次香附藥材 （生香附），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液6份，連續進樣6次，測定色譜圖，對主要峰峰面積進行比較，結果6次測定色譜圖保留時間穩定，主要峰峰面積相對RSD為0.72%，重現性良好，符合規定。

2.2 指紋圖譜測定

2.2.1 香附不同炮制品的制備

根據《中藥炮制學》[2]對香附進行不同方法的炮制。

2.2.1.1 生香附 取原藥材100 g，除去毛須及雜質，碾成綠豆大顆粒，浸透或切薄片，干燥，篩去碎屑備用。

2.2.1.2 醋香附（醋炒）取凈香附飲片100 g，加20 g米醋拌勻，悶潤至醋被吸盡，置炒制容器內，用文火加熱炒干，取出晾涼備用。

2.2.1.3 酒香附 取凈香附飲片100 g，加入20 g黃酒拌勻，悶潤至黃酒被吸盡，置炒制容器內，用文火加熱炒干，取出晾涼，篩去碎屑備用。

2.2.1.4 香附炭 取凈香附飲片100 g，置炒制容器內，用中火加熱，炒至表面焦黑色，內部焦褐色，噴淋清水少許，滅盡火星，取出晾干，涼透，篩去碎屑備用。

2.2.2 香附及不同炮制品指紋圖譜研究

分別取香附及不同炮制品依照“2.1.2”制備供試品，于上述色譜條件下進樣記錄指紋圖譜。

2.3 結果

2.3.1 對照品、生香附及炮制品提取液色譜圖

對照品、生香附及炮制品提取液色譜圖，見圖1。

圖1 香附指紋圖譜

2.3.2 不同炮制品甲醇提取物主要色譜峰保留時間及峰面積

不同炮制品甲醇提取物主要色譜峰保留時間及峰面積，見表1。

結果顯示，16號峰為α-香附酮的色譜峰，作為基準峰。1號峰的峰面積變化明顯，醋香附＞酒香附、香附炭＞生香附，各炮制品峰面積均遠大于生香附，而醋香附的峰面積明顯大于其他炮制品；2號峰的峰面積，香附炭＞酒香附＞醋香附＞生香附，各炮制品峰面積差異均顯著；3號峰的峰面積，香附炭＞醋香附＞酒香附＞生香附，香附炭峰面積遠大于其他各炮制品；4、5、8、9、10、13、14、16、17 號峰中香附炭遠小于其他炮制品，生香附、醋香附、酒香附的峰面積變化不大；6號峰生香附、醋香附、酒香附變化不大，香附炭在該保留時間無峰；7號峰的峰面積，生香附＞酒香附＞香附炭＞醋香附，醋香附、香附炭峰面積顯著小于生香附、酒香附，生香附、酒香附變化不大；18號峰的峰面積，生香附＞醋香附＞酒香附＞香附炭，各炮制品峰面積變化明顯；19號峰僅生香附、香附炭有峰，且生香附峰面積，遠大于香附炭，而酒香附、醋香附均無峰；20、21號峰的峰面積，酒香附＞醋香附＞生香附＞香附炭，生香附、醋香附峰面積差異不大，而酒香附遠大于其他炮制品，香附炭峰面積遠小于其他炮制品；11、12、15號峰無明顯差異。

3 討論

實驗過程中對不同流動相及柱溫進行了考察，結果顯示，柱溫在30℃時，以甲醇-水為流動相梯度洗脫能使樣品中各成分的色譜峰較好分離，60 min后無色譜峰出現。

表1 香附炮制品甲醇提取物主要峰的保留時間及峰面積

對香附不同炮制品指紋圖譜進行比較，結果顯示不同炮制品之間成分差異顯著，主要表現在30 min后主要峰的減少與30 min前主要峰的增加，即脂溶性成分的減少與水溶性成分的增加，與傳統中藥炮制理論相一致。

中藥成分復雜，將指紋圖譜研究應用于中藥炮制的研究與單一成分研究相比，更能真實地反映炮制對中藥成分的影響，如能結合成分結構鑒定，將能得到更詳盡的數據，對炮制引起的中藥成分變化做出更深入的描述。

歷代本草及中醫藥專著中記載香附的炮制品種繁多，唐代有炒制法；宋代有蒸制、煮制、酒制、米泔浸后蒜仁制、石灰制、膽汁制、童便粗鹽水制、炭制等；元代有醋煮制、童便制、麩炒制；到了明、清時代，除沿用元代以前的炮制方法外，最突出的是在輔料制方面增加較多，如有酒、醋、姜、童便的“四制香附”、“五制香附”、“六制香附”、“七制香附”等炮制方法[2]。《本經逢原》[3]記載：“入血分補虛童便浸炒；調氣鹽水浸炒；行經絡酒浸炒；消積聚醋浸炒；氣血不調，胸膈不利，則四者兼制；肥盛多痰，姜汁浸炒；止崩漏血，童便制炒黑；走表藥中則生用之”。《本草綱目》[4]也對其有“生則上行胸膈，外達皮膚；熟則下走肝腎，外徹腰足。炒黑則止血，得童溲浸炒則入血分而補虛，鹽水浸炒則入血分而潤燥……酒浸炒則行經絡，醋浸炒則消積聚，姜汁炒則化痰飲。”的記載，被譽為“血中之氣藥”、“氣病之總司，女科之主帥”。本文主要對現代臨床常用的生香附、醋香附、酒香附和香附炭4種炮制品的指紋圖譜進行了分析。

香附主要含有揮發油類成分，其所含揮發油類成分為0.65%～1.40%，迄今已從其揮發油中分離出了140多種成分，包括單萜、倍半萜及其氧化物，多數已確定其結構式，主要為α-香附酮、α-香附烯 （含量之和約占揮發油的28.85%）[5-7]。此外，香附還有糖類、生物堿類、苷類、黃酮類、酚類和三萜類化合物[8-9]，但相關結構鑒定報道尚少。本文采用指紋圖譜對香附不同炮制品進行初步分析，為具體成分的分離鑒定奠定了基礎。

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