復方首烏藤合劑微生物限度檢查的驗證

張 婷，鄭紹忠，劉全芳

解放軍第一七五醫院（廈門大學附屬東南醫院）藥劑科，福建 漳州 363000

微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項目，目前在國外也越來越受到重視，每版藥典收載的品種也越來越多。復方首烏藤合劑是我院自制的中成藥口服液，有滋陰清肝、清心安神作用，主要用于神經衰弱性失眠、眩暈及腦外傷性頭痛、頭昏等。《中國藥典》2010年版規定建立微生物限度檢查法時，應對該方法進行驗證，以確定該方法的可行性。筆者依據《中國藥典》2010年版二部附錄[1]對該品種進行了菌落計數和控制菌檢查方法的驗證[2]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DG-2B多功能恒溫箱（上海醫療器械廠）；HWS-400型恒溫恒濕箱（上海精宏實驗設備有限公司）；LDZX-40SCI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；101-2A型數顯式電熱恒溫干燥箱（上海陽光實驗儀器有限公司）。

1.2 藥品

復方首烏藤合劑（解放軍第一七五醫院制劑室，40 ml/瓶，批號：100609、100623、100721）。

1.3 試驗用菌株

大腸埃希菌（escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、黑曲霉（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]和白色念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]，以上菌種均購于廈門市藥品檢驗所，金黃色葡萄球菌為第三代，大腸埃希菌為第二代，其余菌均為第四代。

1.4 培養基

營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、MUG培養基，以上培養基均購于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.5 稀釋液

pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，購于廣東環凱微生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 菌落計數方法的驗證[3]

2.1.1 供試液的制備

用pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將復方首烏藤合劑稀釋成為1∶10的供試液，充分混勻備用。

2.1.2 菌液制備

2.1.2.1 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物用接種棒接種至營養肉湯培養基中，于（35±1）℃培養 18～24 h。

2.1.2.2 取白色念珠菌的新鮮培養物用接種棒接種至改良馬丁瓊脂培養基中，于（25±1）℃培養 24～48 h；

上述培養物均用滅菌生理鹽水制成每毫升含菌數小于100 cfu的菌懸液，做活菌計數用。

2.1.2.3 取黑曲霉新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，于（25±1）℃培養 5～7 d，使黑色的霉菌孢子大部分覆蓋培養基斜面為宜，加入5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯-80的滅菌生理鹽水并輕輕振搖洗脫下霉菌孢子，過濾孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯-80的滅菌生理鹽水制成每毫升含菌數小于100 cfu的菌懸液，做活菌計數用。

2.1.3 菌落計數方法的驗證操作

試驗組：分別吸取上述制備好的1∶10供試液1 ml注入平皿中，再分別加入上述制備好的的5種菌的菌懸液各1 ml，每種菌平行制備2份，立即傾注營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基。

供試品對照組：分別吸取上述制備好的1∶10供試液1 ml注入平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每種培養基平行制備2份，以測定供試品的本底菌數。

菌液組：取上述制備好的5種菌的菌懸液1 ml注入平皿內，每種菌平行制備2份，立即傾注營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，測定所加的試驗菌數，并計算回收率。回收率公式為回收率（%）＝（試驗組菌落計數-供試品對照組菌落計數）/菌液組菌落計數×100%。

以上營養瓊脂培養基置30～35℃培養48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基置23～28℃培養72 h，結果見表1。

表1 各試驗菌株的回收率

由表1可見，筆者對復方首烏藤合劑采用平皿法，經過3次平行試驗，5種菌的回收率均大于70%。故本品的細菌、霉菌、酵母菌數的測定可依據《中國藥典》2010年版直接取樣采用常規法。

2.2 控制菌檢驗方法的驗證[4]

2.2.1 陽性試驗組

取上述1∶10供試液10 ml加至100 ml膽鹽乳糖培養基中，再加入10～100 cfu的大腸埃希菌，依相應控制菌檢查方法進行檢查。

2.2.2 陰性菌對照組

方法同試驗組，陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌，依相應控制菌檢查方法進行檢查。見表2。

表2 控制菌的方法驗證結果

從表2可以看出，采用常規法檢驗復方首烏藤合劑的控制菌，陽性試驗組呈陽性反應，陰性菌對照組呈陰性反應，故可用該法進行復方首烏藤合劑控制菌的檢查。

3 討論

驗證試驗結果表明復方首烏藤合劑無抑菌作用，可依據《中國藥典》2010年版按常規方法進行微生物限度檢查。

筆者發現，復方首烏藤合劑靜置一段時間后會生成沉淀，在試驗時，應充分搖勻，使其分散均勻，且本品雖進行了10倍稀釋，但顏色依然較深，在光線較暗的環境下進行菌落計數時不容易分辨菌落，因此應在光源充足的環境下進行菌落計數，對疑似菌須進行菌落培養，確定其是否為菌，以免發生漏數、少數現象，造成試驗結果不準確。

菌落數的控制在小于100 cfu/ml是試驗過程的一大難點，是一項較耗時的操作過程，通常需要多次實踐才能夠得到符合要求的菌落數。菌落的生長繁殖能力極其旺盛，呈指數級別遞增，因此，在用接種棒接種至相應培養基進行增菌，并進行稀釋這個過程的重現性很差，很難在同一個稀釋級得到相同數目的菌落數，筆者通過多次試驗，并查閱相關資料，發現可將細菌稀釋至10-6（真菌稀釋至10-5），并在其附近選取稀釋至10-5～10-7（真菌選取10-4～10-6）的菌懸液，每個稀釋級取1.0 ml與0.5 ml同步試驗，可大大提高菌落數在100 cfu/ml的范圍，減少一些繁瑣且不必要的操作。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄93.

[2]呂毅.麻杏止咳糖漿的微生物限度檢查[J].華西藥學雜志，2009,24(1):102-103.

[3]楊靜,陳偉,馬寧,等.抗腦衰膠囊微生物限度檢查方法學驗證[J].醫學理論與實踐,2009,22(1):116-117.

[4]李智勤,路東旭,李金龍.消痛貼膏微生物限度檢查方法的建立[J].時珍國醫國藥,2009,20(2):464-465.