重組人5型腺病毒在體外對A549細胞的影響

蔣 力，侯 兵，崔珂釩，閔家新

(中國人民解放軍第三軍醫大學新橋醫院胸外科，重慶 400037)

腫瘤的發生是多因素、多階段、多步驟的復雜過程。在本研究中，筆者綜合評價了重組人5型腺病毒在體外的抗腫瘤效應，揭示了其對腫瘤細胞生物學效應的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Model 2300 CO2型細胞孵育箱(美國Shellab公司);移液器(德國Eppedorf公司)。A549細胞(由第三軍醫大學西南醫院腦外科夏永智博士惠贈);重組人5型腺病毒(商品名安柯瑞?，上海三維生物技術有限公司，批號為20110401);RPMI 1640培養基、小牛血清均購自GibcoPBRL公司;Transwell小室、MTT試劑盒均購自美國Sigma公司;TUNEL試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 A549 細胞培養及傳代

將復蘇后的A549細胞置含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，于5%CO2和37℃、飽和濕度的孵育箱中培養，細胞貼壁形態正常，生長良好，隔天換液并傳代1次;細胞處于對數生長期、成活率大于95%時，以0.25%胰酶消化培養瓶內單層細胞，將細胞懸液移入離心管內，常溫下800～1000 r/min低速離心5 min，吸去上清液，加入無血清RPMI 1640培養基，重懸細胞，計數板計數細胞。在96孔板中分3組，每組設5個復孔，每孔取3×105個/L細胞，放入孵育箱中培養24 h后用于轉染。

1.2.2 細胞增殖曲線測定

采用3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法檢測加入重組人5型腺病毒(質量濃度分別為5，10，15，20μg/mL)培養時 A549 細胞(試驗組)12，24，48，72 h 時內皮細胞的存活率。以正常生長的A549細胞為對照組。用含10%胎小牛血清的培養液配成單個細胞懸液，接種到96孔板，每孔1000～10000個細胞，每孔體積200 μL，培養3～5 d后，每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結晶物充分融解，選擇490 nm波長在酶聯免疫監測儀上測定各孔吸光度值，試驗結果用細胞存活率表示。細胞存活率(%)=試驗組吸光度值/對照組吸光度值×100% 。

1.2.3 細胞遷徙試驗

將小室放入24孔培養板中，在上室加入300 μL預溫的無血清培養基，室溫下靜置15～30 min，使基質膠水化，吸去剩余培養液，制備無血清細胞懸液(2～3×105個/mL);24孔板下室加入500 μL含20%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養基，取細胞懸液200 μL加入Transwell小室，注意防止下層培養液和小室間產生氣泡，常規培養12～24 h;取出小室，用棉簽擦去基質膠和上室一側的細胞，用手術刀將膜切下，用90%酒精常溫固定30 min，0.1%結晶紫常溫染色10 min，清水漂凈，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，取3～5個視野計數細胞個數。將上室液更換為質量濃度為20μg/mL的重組人5型腺病毒培養液，重復以上試驗步驟。

1.2.4 細胞周期檢測

將A549細胞分為對照組及試驗組，每組12孔，接種到24孔板內。24 h后，A549細胞試驗組換為質量濃度為20μg/mL的重組人5型腺病毒無血清培養液，培養3 d后，以0.25%胰酶消化，收集細胞，800 r/min離心5 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗，吹打成單細胞懸液，70%冷乙醇4℃下固定24 h，RNAase消化，碘化丙啶標記，在激發光波長488 nm、檢測光波長610 nm下用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5 細胞凋亡試驗

將A549細胞分別按每孔4×104個/mL、每組12孔接種到24孔板，共兩組。24 h后，一組12孔更換為質量濃度為0.20μg/mL的重組人5型腺病毒無血清培養液，設為A549細胞試驗組，其余為對照組。72 h后將細胞用3.7%中性福爾馬林固定10 min，經100%，95%，70%梯度濃度的酒精各水化5 min，磷酸鹽緩沖液室溫蕩洗10 min，每孔滴加 50 μL Cytonin，室溫 30 min，DNase－free水洗 2 次，每次2 min，加入新鮮配置的3%H2O2溶液，室溫5 min，磷酸鹽緩沖液洗1 min，TdT標記緩沖液室溫孵育5 min，每孔滴加50 μL標記反應混和液，37℃ 1 h后用TdT終止緩沖液室溫作用5 min，倒置熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光顆粒者為凋亡細胞。

2 結果

2.1 重組人5型腺病毒對細胞增殖的影響

結果見表1。

表1 不同質量濃度重組人5型腺病毒對A549細胞存活率的影響(%，)

表1 不同質量濃度重組人5型腺病毒對A549細胞存活率的影響(%，)

注:與對照組相比，＊P＜0.01;與同一濃度前一時相比較，△P＜0.01。

2.2 細胞遷徙試驗

結果見圖1。重組人5型腺病毒能顯著抑制A549細胞的遷徙能力。正常A549細胞與加入20μg/mL重組人5型腺病毒培養的A549細胞比較，遷徙試驗結果有顯著性差異(P＜0.01)。

圖1 重組人5型腺病毒對A549細胞遷徙的影響

2.3 重組人5型腺病毒對內皮細胞細胞周期的影響

以含重組人5型腺病毒質量濃度為20μg/mL培養液培養72 h后，經細胞周期測定，試驗組G0/G1期A549細胞所占比例為77.41%，S 期細胞 22.41%，G2－M 期細胞占 2.19%;對照組 G0/G1期A549細胞所占比例為76.97%，S期細胞占9.21%，G2－M期細胞占13.62%。結果顯示，試驗組細胞被阻滯于S期，細胞增殖顯著被抑制(P ＜0.01)。結果見圖 2。

圖2 重組人5型腺病毒對A549細胞周期分布的影響

2.4 重組人5型腺病毒對細胞凋亡的影響

以含重組人5型腺病毒質量濃度為20μg/mL的培養液培育A549細胞72 h后，TUNEL法檢測細胞凋亡。結果顯示，加入重組人5型腺病毒培養后，A549細胞凋亡數較正常培養A549細胞明顯增加(n=20，P ＜0.01)，見圖 3。

圖3 重組人5型腺病毒對細胞凋亡的影響

3 討論

腫瘤形成是一個多因素、多基因參與的過程，其中p53基因的失活對腫瘤形成起著重要作用。p53基因與人類50%的腫瘤有關，目前發現的有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌、軟組織肉瘤、卵巢癌、腦瘤、淋巴細胞腫瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等[2]。重組人5型腺病毒是利用基因工程技術對人5型腺病毒(Ad5)進行基因重組而得到的一種溶瘤腺病毒，其刪除了人5型腺病毒的E1B－55 kD和E3區19 kD基因片段，能在腫瘤細胞中特異性復制而最終溶瘤[3]。

重組人5型腺病毒注射液特異性殺死腫瘤細胞的原理有:直接在腫瘤細胞中復制、包裝，最終導致腫瘤細胞裂解;增加受感染腫瘤細胞對由細胞因子等引起的免疫反應的敏感性，加速受感染細胞的死亡;所表達的抗原誘發MHC I在被感染腫瘤細胞表面的表達，引導機體產生針對性的T細胞免疫反應;E1A區可增強腫瘤細胞對化學治療的敏感性[4]。

本研究證實，重組人5型腺病毒在體外能明顯抑制A549細胞的生長并促進其調亡。但是，將重組人5型腺病毒制成臨床抗癌藥物仍需克服一些難題，如藥效的特異性及局部藥物濃度過低等。

[1]Kenneth R，Rog Lski，Svend O，et al.In Vivo Antitumor Activity of ONYX－015 Is Influenced by p53 Status and Is Augmented by Radiotherapy[J].Cancer Research，2000，60:1193－1196.

[2]Thomas Rothmann，Arnd Hengstermann，Noel J，et al.ONXY－015，Replication of ONYX－015，a Potential Anticancer Adenovirus，Is Independent of p53 Status in Tumor Cells[J].Journal of Virology，1998，72(12):9470－9478.

[3]Brett R，Dix，Sara J.Braithwaite.Does the antitumor adenovirus ONYX－015/dl1520 selectively target cells defective in the p53 pathway[J].Journal of Virology，2001，75(12):5443－5447.

[4]Cheng－Ta Yang，Liang You，Kazutsugu Uematsu，et al.P14ARF Modulates the cytolytic effect of ONYX－015 in mesothelioma Cells with wild－type p53[J].Cancer Research，2001(61):5959－5963.