國產和進口鹽酸氨溴索片的人體生物等效性研究

王國才，張 丹，楊 漫，韓 靜，鄭天雷，王振龍，王 濤，劉會臣

(航天中心醫院臨床藥理室，北京 100049)

氨溴索(ambroxol)又叫溴環乙胺醇，是溴己胺的體內活性代謝產物，是一種黏痰溶解劑及肺表面活性物質合成促進劑，主要用于急、慢性呼吸道疾病引起的痰液黏稠、咳痰困難等。本試驗采用液相色譜－串聯質譜聯用法(LC－MS/MS)測定人血漿中的氨溴索濃度，研究鹽酸氨溴索片人體相對生物利用度并評價其生物等效性。

1 儀器與試藥

API 3200型三重四極桿串聯質譜儀，配電噴霧離子化源(ESI)和Analyst 1.4.2數據處理軟件;Prominence 20A型液相色譜儀，包括LC－20AD型二元泵，DGU－20A3型脫氣機，SIL－20A型自動進樣器，CTO－20A型柱溫箱，CBM－20A系統控制器;QB－600型高速振蕩混合器(海門市其林貝爾儀器);Sigma 3－18K臺式高速離心機(德國Sartorius Stedim Biotech)。鹽酸氨溴索片(受試制劑，北京京豐制藥有限公司，規格為30 mg/片，批號為100401;參比制劑，上海勃林格殷格翰藥業有限公司，規格為30 mg/片，批號為984220);鹽酸氨溴索對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為100599－200502);鹽酸苯海拉明對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為0066－9705);甲醇(色譜純，Fisher公司，批號為094345);超純水。

2 方法與結果

2.1 受試者選擇

選擇 20 名受試者，平均年齡(24±2)歲，體重(61.3 ±5.2)kg，身高(1.71±0.06)m。試驗前體格檢查、實驗室檢查(血常規、尿常規、肝功能、腎功能、血糖、乙型病毒性肝炎表面抗原、梅毒、艾滋病抗體)、心電圖檢查、胸片檢查均合格。受試者無過敏體質、藥物過敏史、暈針史，試驗前兩周內未用任何的藥物。試驗前均簽署知情同意書。

2.2 給藥方案與血樣采集

根據國內外已上市氨溴索片的藥品說明書，本試驗采用臨床常用劑量30 mg。采用隨機雙周期自身交叉對照試驗設計，每名受試者分2周期口服受試制劑和參比制劑各1次，間隔時間為1周。受試者于試驗前1天下午入住藥物臨床試驗病房，吃清淡晚餐，餐后禁食不禁水;第2天早上8:00點，由醫護人員發放受試制劑或參比制劑，受試者空腹給藥，用200 mL溫開水送服。用藥后保持上身直立狀態2 h，其后可自由飲水，4 h后統一進食標準餐。試驗過程中，禁用其他藥物或含咖啡因的飲料，禁止吸煙、飲酒，按時休息，避免劇烈活動。受試者于用藥前和用藥后 0.25，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，12，24，36 h 時從肘靜脈取血約 3 mL，3000 r/min離心10 min，取血漿，立即置－80℃冰箱中保存備測。

2.3 血藥濃度測定

2.3.1 色譜條件及質譜條件

預柱:Phenomenex C18柱(4.0 mm ×3.0 mm，5 μm);色譜柱:Zorbax SB －C18Narrow Bore 柱 (150 mm ×2.1 mm，5 μm);流 動相:甲醇－含0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨(65∶35);流速:0.3 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL。

離子源:離子噴霧離子化源;離子噴射電壓:4500 V;溫度:450 ℃;源內氣體 1(GS1，N2)壓力:45 psi;氣體 2(GS2，N2)壓力:35 psi;氣簾氣體(N2)壓力:20 psi;正離子方式監測;掃描方式為多重反應監測(MRM);用于定量分析的離子反應分別為 m/z 379.1→m/z 264.1(氨溴索)和 m/z 256.2 → m/z 167.3(苯海拉明)，解簇電壓(DP)分別為 45，15 V，碰撞能量(CE)分別為 29，20 eV;碰撞氣(CAD，N2)壓力:3 psi;Q1分辨率:UNIT;Q3分辨率:LOW。

2.3.2 溶液制備

精密稱取鹽酸氨溴索對照品10.96 mg(相當于10.00 mg氨溴索)，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成1.00 g/L的氨溴索母液。精確吸取氨溴索母液300 μL，置10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成質量濃度為30.0 μg/mL的氨溴索對照品貯備液。取適量氨溴索對照品貯備液，用乙腈稀釋成質量濃度分別為30.0，300，2400 ng/mL的質控溶液。分別取適量氨溴索對照品貯備液，用空白血漿稀釋成質量濃度分別為1.00，3.00，10.0，30.0，100，300 ng/mL 的標準曲線樣本。分別取適量氨溴索對照品貯備液，用空白血漿稀釋成質量濃度分別為3.00，30.0，240 ng/mL的質控樣本。精確稱取鹽酸苯海拉明 5.40 mg(相當于苯海拉明4.8 mg)，溶于6 mL甲醇－水(1∶1)的混合溶液中，配制成0.800 g/L的母液;精確取10 μL苯海拉明母液，置990 μL乙腈中，配制成相當于苯海拉明8.00 μg/mL的貯備液;精確取312.5 μL苯海拉明貯備液，置50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成質量濃度為50.0 ng/mL的苯海拉明內標溶液，于4℃冰箱中保存。

2.3.3 血漿樣本處理

取血漿 100 μL，分別加入內標溶液 10 μL，乙睛 290 μL，渦流1min，10000 r/min離心 10 min，取 150 μL上清液于進樣瓶中進行分析。

2.3.4 方法學考察

質譜分析:用蠕動泵分別將氨溴索的乙腈溶液(500 ng/mL)和內標苯海拉明的乙腈溶液(1.00 μg/mL)以5 μL/min的恒定流速泵入MS/MS系統，相應的二級全掃描質譜圖見圖1。

圖1 二級全掃描質譜圖

專屬性考察:在擬訂的色譜條件下，空白血漿中的內源性物質不干擾氨溴索和苯海拉明的測定。測定低、中、高3個質量濃度血漿樣本中氨溴索的基質效應分別為(112.2±2.9)% ，(110.3±3.1)%，(114.4 ±2.9)%，平均基質效應為(112.3 ± 3.3)%;苯海拉明的基質效應為(103.2±3.5)%。相關色譜圖見圖2。

標準曲線繪制和定量下限確定:取標準曲線樣本100 μL，按2.3.3項下操作，以血漿中待測物質量濃度為橫坐標、待測物與內標的峰面積比值為縱坐標，用加權(W=1/x2)最小二乘法進行回歸運算，求得回歸方程 Y=0.0163 X －0.00152(r=0.9992)。最低定量質量濃度為1.00 ng/mL，氨溴索質量濃度的線性范圍為1.00 ～300 ng/mL。

準確度與精密度試驗:按2.3.3項下操作，氨溴索低、中、高3個質量濃度的質控樣本，每質量濃度6樣本，連續測定3個分析批次，以同1分析批的工作曲線計算質控樣本的質量濃度，根據測定結果計算方法的準確度與精密度。結果見表1，RE均在±15%以內，批內、批間 RSD均小于15%。

圖2 高效液相色譜圖

表1 準確度與精密度試驗結果(n=18)

提取回收率試驗:按2.3.3項下操作，處理氨溴索低、中、高3個質量濃度的質控樣本，由標準曲線求出各樣品的質量濃度，計算提取回收率。低、中、高3個質量濃度血漿樣品中氨溴索的提取回收率分別為(83.4 ±2.5)% ，(91.0 ±1.2)% ，(92.4 ±4.1)%，平均提取回收率為(88.9±4.9)%;血漿樣品中苯海拉明的提取回收率為(90.0±2.2)%。

2.4 生物等效性評價

圖3 平均血藥濃度－時間曲線

表2 兩種鹽酸氨溴索片在人體內的藥代動力學參數

20名志愿者口服氨溴索片受試制劑和參比制劑后，平均血藥濃度－時間曲線見圖3，主要藥代動力學參數見表2。鹽酸氨溴索片受試制劑的平均相對生物利用度為(99.3±14.8)%(以 AUC0－t計)和(98.5 ±14.2)%(以 AUC0－∞計)。主要藥代動力學參數血藥峰濃度(Cmax)、藥時曲線下面積(AUC0－t，AUC0－∞)經對數轉換后進行方差分析、雙向單側 t檢驗和90%置信區間計算，達峰時間(tmax)采用配對Wilcoxon法檢驗，結果表明2種制劑具有生物等效性。

3 討論

國內外測定氨溴索血藥濃度的方法主要是高效液相色譜法[1－5]和液質聯用法[6－11]，但普遍存在著血漿用量大[2－5]、檢測時間長[10]、樣本處理過程復雜[8－9]等問題。徐紅蓉等[6]研究鹽酸氨溴索分散片的藥代動力學和生物等效性時，檢測時間為4.5 min，但內標需要避光，增加了樣本處理的難度。本試驗采用液相色譜－串聯質譜法測定氨溴索的血藥濃度，選用苯海拉明為內標(無需避光)，沉淀蛋白處理樣品，血漿用量僅100 μL，檢測時間為3.5 min。試驗方法選擇性好、靈敏度高、檢測時間短，能夠滿足氨溴索片的人體藥代動力學研究及生物等效性研究的需要。本試驗獲得了鹽酸氨溴索片受試制劑與參比制劑的主要藥代動力學參數，生物等效性評價顯示兩種制劑生物利用度相當，結果表明國產和進口鹽酸氨溴索片在體內的吸收、分布、消除過程一致，統計學分析證明兩種鹽酸氨溴索片生物等效。

[1]李 珍，徐學君，沈意翔，等.國產鹽酸氨溴索片在健康人體內的生物等效性評價[J].中國藥學雜志，1999，34(8):541－543.

[2]戈升榮，安富榮，袁 靜，等.國產與進口鹽酸氨溴索片的人體生物等效性研究[J].上海第二醫科大學學報，2002，22(1):26－28.

[3]呂宗杰，鄭 永.鹽酸氨溴索緩釋片人體生物等效性研究[J].重慶醫科大學學報，2009，34(11):1552－1555.

[4]陶宜富，莫 陵，肖大偉，等.鹽酸氨溴索口腔崩解片人體生物等效性研究[J].臨床藥學，2008，19(5):341 －343.

[5]劉書銘，周遠大.鹽酸氨溴索口腔崩解片人體生物等效性研究[J].中國藥房，2006，17(12):923 －925.

[6]徐紅蓉，汪 紅，陳偉力，等.氨溴索分散片在健康志愿者的藥代動力學和生物等效性[J].中國臨床藥理學雜志，2002，22(3):180－183.

[7]薛洪源，楊漢煜，賀文濤，等.鹽酸氨溴索口腔崩解片的生物等效性研究[J].醫藥導報，2010，29(1):27 －30.

[8]陳 琳，高 署，李俊杰，等.LC－MS/MS法測定人血漿中鹽酸氨溴索顆粒濃度及生物等效性研究[J].江西醫學院學報，2006，46(6):43－50.

[9]溫預關，廖日房，尹惠標，等.鹽酸氨溴索口崩片與普通片人體生物等效性比較[J].中國醫院藥學雜志，2007，27(3):293－296.

[10]HangTJ，ZhangM，SongM，etal.Simultaneousdetermination and pharmacokinetic study of roxithromycin and ambroxol hydrochloride in human plasma by LC－MS/MS[J].Clin Chim Acta，2007，382(1－2):20－24.

[11]Lee HJ，Joung SK，Kim YG，et al.Bioequivalence assessment of ambroxol tablet after a single oral dose administration to healthy male volunteers[J].Pharmacol Res，2004，49(1):93－98.