高效液相熒光色譜法測定人血漿中坎地沙坦的質量濃度

葉朝清，于翠霞，楊曉紅，朱余兵

(南京醫科大學附屬南京第一醫院，江蘇 南京 210006)

坎地沙坦由Astra公司和日本武田株式會社開發，1998年7月于瑞典首次上市，是一種選擇性血管緊張素Ⅱ受體(AT)拮抗劑，可阻斷AT1受體，松弛血管平滑肌，增加鹽排泄，抑制細胞肥大(增生)，降低血壓而不改變心率或心輸出量，阻斷血管神經收縮和醛固酮的分泌，從而起到降壓作用[1－2]。坎地沙坦長期應用可逆轉左室肥厚，降低左室重量指數，可治療充血性心力衰竭[3]。本研究旨在建立一種快速、靈敏、專屬性強、操作簡便的高效液相熒光色譜(HPLC－FLU)法，以測定血漿中坎地沙坦濃度，并用于坎地沙坦的臨床藥代動力學研究。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent);超純水儀(美國Millipore);電子天平(Mettler Toledo公司);低溫離心機(上海科學儀器廠)。坎地沙坦標準品(中國藥品生物制品檢定所，純度為98.9%，批號為100685－200803);空白人血漿，由南京市中心血站提供;甲醇(色譜純，TEDIA公司，批號為1006908)，超純水(自制)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:BaiAn－C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 －0.02 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=4.9，70∶30);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:λex=265 nm，λem=395 nm。在此條件下，坎地沙坦保留時間為5.5 min，各目標化合物峰形良好，能有效分離，無雜峰干擾測定，基線平穩(見圖1)。

2.2 溶液制備

圖1 血漿中坎地沙坦高效液相色譜圖

精密稱取坎地沙坦標準品10.0 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.0 g/L的坎地沙坦標準品儲備液。精密吸取該貯備液1 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得100 mg/L的坎地沙坦甲醇溶液;依次稀釋，配成質量濃度為10 mg/L，1 mg/L，100 μg/L的坎地沙坦甲醇標準溶液。稱取磷酸二氫鉀2.72 g，溶于1000 mL超純水中，加磷酸1 mL，搖勻，用三乙胺調pH為4.9，即得磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀濃度為20 mmol/L)，置4℃冰箱中冷藏備用。

2.3 血樣配制

取離心管數支，分別精密加入不同量的坎地沙坦標準溶液后，以氮氣流吹干，加入空白血漿0.5 mL，渦旋1 min，配成分別含坎地沙坦 0，2，5，10，20，50，100，300 μg/L 的標準含藥血樣，同法依次配成血漿中分別含坎地沙坦5，20，250 μg/L的低、中、高質控血樣。

2.4 血漿樣品處理

精密加入血漿樣品0.5 mL，置離心管中，加入高氯酸(20%)沉淀液 100 μL，渦旋 1 min，于 16000 r/min離心 5 min。吸取上清液，置自動進樣分析小瓶中，精密吸取20 μL進樣分析。

2.5 方法學考察

線性關系考察:將系列濃度標準含藥血樣，按2.4項下方法操作，每種質量濃度做5份樣品，記錄色譜圖及坎地沙坦峰面積。以坎地沙坦峰面積的平均值(As)對血藥濃度(C)作回歸計算，得回歸方程 As=0.1277 C －0.0419，r=0.9984(n=5)。結果表明，坎地沙坦血漿質量濃度在2～300 μg/L范圍內與峰面積線性關系良好，定量下限質量濃度為2 μg/L。

回收率及精密度試驗:取離心管數支，于離心管中精密加入不同質量濃度的坎地沙坦標準溶液適量，以氮氣流吹干后，加入0.5 mL超純水，渦旋1 min，配成質量濃度分別為5，20，250 ng/mL的坎地沙坦溶液，精密加入20%高氯酸沉淀液100 μL，16000 r/min離心5 min，精密吸取上清液30 μL進樣分析，記錄色譜圖和峰面積(Ax)。另取離心管數支，精密加入不同質量濃度的坎地沙坦標準溶液適量，以氮氣流吹干后，精密加入0.5 mL空白血漿，渦旋1 min，配成含坎地沙坦5，20，250 ng/mL的含藥血漿，每種濃度各做5份樣品，按2.4項下操作。記錄色譜圖和峰面積(As)，上述 Ax和 As的比值即為坎地沙坦的絕對回收率，將 As代入相應標準曲線方程，計算測得質量濃度和加入質量濃度的比值即為相對回收率，同法可算出批內、批間精密度 RSD。結果見表1。

表1 回收率與精密度試驗結果(n=5，)

表1 回收率與精密度試驗結果(n=5，)

回收率(%) 精密度 RSD(%)加入質量濃度(μg/L)520250絕對85.8 ± 6.984.1 ± 3.987.1 ± 3.2相對97.3 ± 6.390.5 ± 6.495.2 ± 1.0批內6.24.01.8批間7.05.62.4

穩定性試驗:取低、中、高3種質量濃度質控血樣各5份，1份配制好后立即進樣分析;另外4份血樣中，1份于室溫放置4 h后提取操作，1份放置4 h并提取后再于4℃放置12 h，1份于冰箱中冷凍保存3周后取出化凍，1份在3周內反復凍融3次，然后測定。結果各質量濃度血樣測定值的偏差均小于10%，表明樣品在上述條件下穩定性良好，符合生物樣品分析要求(表2)。

表2 穩定性試驗結果(μg/L)

3 討論

關于坎地沙坦的含量測定文獻報道較多，文獻[4]采用高效液相紫外檢測法，由于血漿中藥物含量較低，內源性物質干擾大，難以達到所需的檢測靈敏度。文獻[5－7]采用HPLC－FLU法，但樣品處理為鹽酸酸化血漿后，用有機溶劑提取，甲醇或流動相溶解殘渣，取上清液進樣分析。此類方法靈敏度雖得到很大提高，但操作過程繁雜，系統誤差大，試驗成本較高，同時有機溶劑對操作者毒害大。筆者采用外標法，血漿樣品經100 μL 20%高氯酸沉淀后，取上清液20 μL進樣分析，h該方法操作簡單、快速、準確度高，避免了有機溶劑的毒性和復雜的操作過程。在對色譜條件進行優化的過程中，筆者比較了緩沖液中磷酸鹽的不同濃度、有機相與水相的不同構成比及流動相的不同pH對分析結果的影響，選擇甲醇－0.02 mmol/L 磷酸二氫鉀緩沖液(70 ∶30，pH=4.9)作流動相，在此條件下，坎地沙坦峰形良好，無雜峰干擾測定，基線平穩，樣品分析時間短(6.5 min)，適合大樣本量的測試。該方法中，磷酸鹽的濃度不宜很高，避免在使用時柱平衡和沖洗時間長，防止磷酸鹽析出堵塞管路。試驗結果表明，該方法樣品處理簡單、特異性強、靈敏度較高、重現性好，符合生物樣品分析要求，可用于該藥的生物樣本中含量的測定和臨床藥代動力學研究。

[1]呂向群.抗高血壓新藥坎地沙坦研究進展[J].中國藥業，2005，14(5):77－79.

[2]黃建耿，李 高，斯陸勤，等.高效液相色譜法測定人血漿中坎地沙坦的含量[J].中國藥師，2005，8(4):293 －294.

[3]Erdmann E，George M，Voct B，et al.The safety and tolerability of candesartan cilexetil in CHF[J].J Renin Angiotensin Aldosterone Syst ，2000，1(11):31 －36.

[4]張永東，魏秀華，王安發，等.HPLC法測定坎地沙坦酯及其有關物質[J].中南藥學，2004，2(2):80－83.

[5]朱余兵，鄒建軍，錢 薇，等.健康受試者口服復方坎地沙坦酯片后坎地沙坦的藥代動力學研究[J].中國臨床藥理學與治療學，2007，12(4):474－477.

[6]周玲潔，戴 維，顧麗華，等.高效液相色譜法測定中國健康志愿者血清中坎地沙坦及坎地沙坦西酯片的人體藥動學[J].復旦學報，2008，35(4):552－555.

[7]金小平，韓 俊，劉亞妮.2種坎地沙坦酯制劑的人體生物等效性研究[J]. 中國藥房，2007，18(11):841 －843.