飲食對石杉堿甲緩釋片藥代動力學的影響研究

魏振滿，丁晉彪，胡 琳，陳紅鴿，吳榮榮，劉萬卉，沙春潔

(1.中國人民解放軍302醫院臨床藥理室，北京 100039; 2.煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005)

石杉堿甲是從天然植物千層塔中提取的生物堿，生物活性高，是一種對真性膽堿酯酶具有高度選擇性的可逆性膽堿酯酶抑制劑，主要用于治療良性記憶障礙及老年性癡呆[1]。將石杉堿甲制成緩釋制劑，目的在于降低達峰血藥濃度，延長達峰時間，減少患者的服藥次數，減少不良反應，提高患者的依從性和生活質量，減輕患者家屬的負擔。筆者研究了石杉堿甲緩釋片的生物利用度受飲食影響的程度，為臨床用藥提供參考。

1 儀器與試藥

API 4000型三重四極桿串聯質譜儀，配有離子噴霧離子化源以及Analyst 1.4.1數據處理軟件(美國Applied Biosystem公司);Agilent 1100型高效液相色譜系統(美國Agilent公司)。石杉堿甲對照品(純度大于99%，山東綠葉制藥有限公司，批號為06020605);內標石杉堿乙(純度大于99%，上海同田生物技術有限公司，批號為06103101;甲醇(色譜純，Burdick＆Jackson公司)，其余試劑為分析純;空白血漿由煙臺市中心血站提供。

2 方法與結果

2.1 受試者選擇

選擇12名受試者，男女各半;年齡20～30歲，平均(23±3)歲;體重指數為19～24;無藥物和食物過敏史，無心血管、呼吸、泌尿、消化道、內分泌、神經系統等病史;試驗前2周內未服任何其他藥物，3個月內未參加過藥物臨床試驗和獻血;無煙酒嗜好;體格檢查及實驗室檢查(含血壓、心率、呼吸頻率、血常規、尿常規、肝功能、腎功能、心電圖、胸片)無異常;了解試驗的目的、藥物性質、可能風險以及自己的權益，并自愿簽署知情同意書。

2.2 給藥方案與血樣采集

本試驗采用自身交叉試驗設計。12名健康受試者隨機進入空腹給藥組和餐后給藥組，6名受試者空腹給予石杉堿甲緩釋片200 μg;另外6名受試者進食高脂、高蛋白食物，30 min后口服石杉堿甲緩釋片200 μg。第1周期結束后，經過7 d的清洗期，兩組受試者交換，進行第2周期試驗。12例受試者均完成全部試驗。受試者于試驗前1天晚20:00點前入Ⅰ期臨床試驗病房，禁食不禁水約12 h;第2天早上8:00點左右服藥，于服藥前及服藥后0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，8，10，12，24，36，48 h 時從上肢肘靜脈取血 4 mL，置肝素抗凝管中放置1 h，以3000 r/min離心10 min，分離血漿，置－70℃下凍存，備用。受試者服藥及取血均在Ⅰ期臨床試驗病房進行，有主治醫師在現場實施監護。

2.3 血藥濃度測定

2.3.1 色譜與質譜條件

色譜柱:Agilent Plus－C18柱(100 mm ×3.0 mm，3.6μm);流動相:甲醇－水(80 ∶20，1 mmol/L 醋酸銨);流速:0.45 mL/min;柱溫:35℃;進樣量:10 μL。離子源:離子噴霧離子化源;離子噴射電壓:5500 V;溫度:550℃;源內氣體1(GS1，N2)壓力:50 psi;氣體2(GS2，N2)壓力:55 psi;氣簾氣體(N2)壓力(CUR):15 psi;碰撞氣(CAD):10 psi;正離子方式檢測;掃描方式為多反應監測(MRM);石杉堿甲和石杉堿乙DP電壓分別為82，94 V，CE電壓分別為41，36 V，用于定量分析的離子反應分別為 m/z 243.4→m/z 210.1和m/z 257.5→ m/z 198.0。

2.3.2 血樣處理

取200 μL血漿樣品，置10 mL具塞離心管中，加入100 μL甲醇－水(80∶20)混合溶劑，加入100 μL內標溶液(20 ng/mL石杉堿乙)，100 μL 1 mol/L碳酸鈉，渦流混合2 min，加入3 mL正己烷－二氯甲烷 －異丙醇(2∶1∶0.1)混合溶劑，渦流混合 7 min，離心10 min(3600 r/min)，取上層有機相，置另一試管中，36℃空氣流下吹干，殘留物加入 100 μL流動相(甲醇 －水，80∶20，1 mmol/L醋酸銨)溶解，渦流混合2 min，取10 μL進行測定。

2.3.3 方法學考察

專屬性考察:分別取人空白血漿，按2.3.2項下方法操作，測得色譜圖1 A;將一定質量濃度的石杉堿甲標準溶液和石杉堿乙溶液加入空白血漿中，同法操作，測得色譜圖1 B;取受試者給藥后收集的血漿樣品，同法操作，測得色譜圖2 C。結果表明，空白血漿中的內源性物質不干擾石杉堿甲和石杉堿乙的測定。

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線繪制與定量下限確定:取人空白血漿200 μL，加入石杉堿甲標準系列溶液100 μL，配制成相當于含石杉堿甲血漿質量濃度為 0.0500，0.200，1.00，2.50，5.00，12.5 ng/mL 的樣品，按2.3.2項下方法操作，進樣10 μL，記錄色譜圖。以待測物質量濃度為橫坐標(X)、待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標(Y)，用加權(W=1/x2)最小二乘法進行回歸運算[2]，求得回歸方程 Y=0.337 X+0.012，r=0.9985(n=6)。結果表明，石杉堿甲質量濃度線性范圍為0.0500～12.5 ng/mL，血漿樣品測定的定量下限為0.0500 ng/mL。

回收率試驗:取空白血漿200 μL，按“標準曲線繪制與定量下限確定”項下方法制備低、中、高 3 個質量濃度(0.100，2.00，10.0 ng/mL)的樣品，每一質量濃度進行6樣本分析，殘留物以流動相溶解，進樣分析。同時，另取空白血漿200 μL，按2.3.2項下方法操作，36℃空氣流下吹干，殘留物加入相應質量濃度的標準溶液和內標溶液各100 μL，渦流混合，進樣測定。低、中、高3個質量濃度樣品的提取回收率分別為74.4%，68.7%，70.1%。

精密度與準確度試驗:取空白血漿200 μL，按2.3.2項下方法配制低、中、高 3 個質量濃度(0.100，2.00，10.0 ng/mL)的質量控制樣品，每一質量濃度進行6樣本分析，連續測定3 d，根據當日的標準曲線計算樣品的濃度、準確度與精密度。結果日內 RSD分別為7.5%，5.7%，4.7%(n=6);日間 RSD 分別為 9.0%，10.1%，2.9%(n=6)。

穩定性試驗:按“標準曲線繪制與定量下限確定”項下方法制備低、中、高 3 個質量濃度(0.100，2.00，10.0 ng/mL)的樣品，共6個樣本，室溫下放置24 h重新進樣，結果所有樣品的相對標準偏差均小于15%，表明樣品在室溫放置24 h的穩定性良好。取石杉堿甲標準溶液 0.100，2.00，10.0 ng/mL 各 100 μL，取 12 個樣本，空氣吹干后，加入200 μL空白血漿，其中6個樣本作為對照，另外6個樣本放于－35℃冰箱冷凍24 h，取出室溫融化，再放入冰箱冷凍2 h，取出于室溫融化后繼續放入冰箱中冷凍2 h，再取出室溫融化后，按2.3.2項下方法操作。結果所有樣品的相對標準偏差均小于11.4%，表明血漿樣品可以進行反復凍融，保障了整個分析過程中的數據真實、可靠。

2.3.4 未知血漿樣本的測定和質量控制

按2.3.2項下方法操作，每批樣品制備一條工作曲線，同時制備低、中、高 3 個質量濃度(0.10，2.00，10.00 ng/mL)的質量控制樣品，每個質量濃度的質量控制樣品進行雙樣本分析。根據每批的工作曲線計算質量控制樣品和未知樣品的質量濃度。上述質量控制樣品中最多允許兩個樣品的質量濃度超出理論值的15%(低質量濃度點為20%)，否則此批數據不被接受。

2.4 血藥濃度－時間曲線繪制

根據測得的血藥濃度繪制藥－時曲線，12名受試者空腹及進食后口服石杉堿甲緩釋片平均血藥濃度－時間曲線見圖2。

圖2 石杉堿甲平均血藥濃度－時間曲線

2.5 藥代動力學參數計算

采用DAS 2.0軟件的統計矩模型計算受試者口服石杉堿甲緩釋片后的藥代動力學參數;采用梯形法計算藥時曲線下面積(AUC)值，以半對數作圖法，由消除相的末端4個濃度點計算半衰期(t1/2)，達峰濃度(Cmax)和達峰時間(tmax)采用實測值。藥代動力學參數見表1。可見，12名受試者進食前后口服石杉堿甲緩釋片主要藥代動力學參數基本相似。

表1 12名受試者空腹和進食后口服石杉堿甲緩釋片的藥代動力學參數

2.6 生物利用度分析

根據 AUC0－t計算得到受試制劑的相對生物利用度平均為(97.5±10.8%)。空腹給藥 Cmax的置信區間為進食后給藥相應參數的76.6% ～87.6%(等效標準為70% ～143%)，說明 Cmax合格，沒有顯著性差異。tmax經非參檢驗得出 P＞0.05，說明 tmax沒有顯著性差異。

3 討論

本研究采用多級離子選擇性檢測，減少了血樣中雜質對色譜峰的干擾，定量限達到0.02 ng/mL，操作簡便、快速、重現性好。因此，該法可用于大樣本量的石杉堿甲血藥濃度的檢測及其藥代動力學和生物利用度的研究。

本試驗比較研究了石杉堿甲緩釋片劑空腹及進食后體內石杉堿甲的藥代動力學特征，主要藥代動力學參數之間無顯著性差異，與文獻報道基本一致[3－4];采用隨機雙交叉試驗設計的方差分析法進行分析，Cmax和 tmax經非參檢驗無顯著性差異(P＞0.05)。盡管進食高脂肪、高蛋白食物不影響該藥的 tmax和 Cmax，但進食后給藥較空腹給藥的 tmax和 Cmax有一定延后和增高，故推薦石杉堿甲緩釋片劑飯前空腹服用。

[1]劉鐵薇.石杉堿甲的藥理作用與臨床研究進展[J].中藥材，2001，24(10):775－776.

[2]鐘大放.以加權最小二乘法建立生物分析標準曲線的若干問題[J].藥物分析雜志，1996，16(5):343 －346.

[3]王 勇，周彥彬，田 娟，等.HPLC/MS/MS法測定人血漿中石杉堿甲的濃度及人體相對生物利用度研究[J].中南藥學，2009，7(8):583－586.

[4]霍 強，李見春，高 署，等.LC/MS/MS法測定人血清中石杉堿甲的濃度及應用[J].中國新藥雜志，2009，18(11):1016－1026.