注射用還原型谷胱甘肽鈉細菌內毒素檢查法研究

王宗春，姜俊勇，周延安，宋金春

(武漢大學人民醫院藥學部，湖北 武漢 430060)

注射用還原型谷胱甘肽鈉臨床用于化學治療(尤其是大劑量化學治療)、放射治療、肝臟疾病、低氧血癥以及有機磷、胺基或硝基化合物中毒的輔助治療。2010年版《中國藥典(二部)》中關于注射劑熱原檢查方法有家兔法和細菌內毒素檢查法2種，其中細菌內毒素檢查法具有靈敏度高、重現性好、簡便易行等優點，已被各國藥典所采用。目前尚未有注射用還原型谷胱甘肽鈉細菌內毒素檢查方法的報道，筆者參照2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪE方法[1]，對本品進行了細菌內毒素檢查方法的研究。

1 儀器與試藥

恒溫水浴箱(江蘇南通嘉程儀器有限公司);微量取液器(50～250 μL，上海金林生化試劑儀器廠);SW－80A型旋渦混合器(上海醫科大學儀器廠);細菌內毒素檢查用具(廈門鱟試劑實驗廠)。注射用還原型谷胱甘肽鈉(昆明積大制藥有限公司，規格為0.6 g/瓶，批號為091205，100212，100409);細菌內毒素檢查用水(BET用水，廈門鱟試劑實驗廠，規格為10 mL/支，批號為091201);細菌內毒素工作標準品(中國藥品生物制品檢定所，規格為10 EU/支，批號為2009－7);鱟試劑(TAL，廈門鱟試劑實驗廠，規格為 0.1 mL，批號為091149，標示靈敏度為0.5 EU/mL;湛江安度斯生物有限公司，規格為 0.1 mL，批號為 090325，標示靈敏度為 0.5 EU/mL)。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核

按2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪE方法[1]操作。結果表明，兩批鱟試劑靈敏度測定值 λc均在0.5～2.0 λ之間，符合規定。

2.2 細菌內毒素限值(L)的確定

細菌內毒素限值 L=K/M[1]。式中 K為人每千克體重每小時最大可接受的細菌內毒素劑量，注射劑為5 EU/(kg·h);M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，人均體重以60 kg計算，按照注射用還原型谷胱甘肽鈉說明書用法用量，本品成人1次最大劑量為 2.4 g，1 h 內滴注完畢，M=2400/(60 ×1)=40 mg/(kg·h)，因此本品的細菌內毒素限值 L=K/M=0.125 EU/mg。

2.3 樣品最小有效稀釋濃度(C)的確定

樣品有效稀釋濃度 C=λ/L。其中 λ為鱟試劑靈敏度，L為細菌內毒素限值，即0.125 EU/mg，目前市售的鱟試劑 λ常為 0.5，0.25，0.125，0.06，0.03 EU/mL，對應的樣品最小有效稀釋濃度為4.0，2.0，1.0，0.5，0.25 g/L。

2.4 干擾預試驗[2－3]

用BET用水將注射用還原型谷胱甘肽鈉配制成質量濃度分別為 4.0，2.0，1.0，0.5，0.25 g/L 的系列溶液，作為供試品陰性對照(NPC)系列。另制備同樣質量濃度的供試品系列溶液，使每一質量濃度的供試品溶液中均含有2 λ細菌內毒素，作為供試品陽性對照(PPC)系列。每一供試品濃度重復兩管，按常規設立陽性對照(PC)管和陰性對照(NC)管。用 λ為0.5 EU/mL的鱟試劑與上述系列溶液進行反應，依法[1]操作，結果顯示以上質量濃度的供試品對細菌內毒素檢查均無干擾現象。為了找出最大不干擾濃度，將樣品配制成質量濃度分別為 64.0，32.0，16.0，12.0，8.0 g/L 的系列溶液，同法試驗，結果見表1。初步判斷最大不干擾質量濃度為8.0 g/L。

表1 干擾預試驗結果

2.5 干擾試驗

根據干擾預試驗結果，用質量濃度為8.0 g/L的供試品溶液及BET用水分別稀釋細菌內毒素工作標準品，配成細菌內毒素最終濃度分別為 1.0，0.5，0.25，0.125 EU/mL 的系列溶液，分別取 0.1 mL加入到已復溶的兩個不同廠家生產的鱟試劑(λ為0.5 EU/mL)管內，每個濃度平行做4管，另取供試品溶液做2支陰性對照管，依法[1]進行干擾試驗。結果見表 2。Et/Es在 0.5～2 之間(Es為以BET用水制成的細菌內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值，Et為用供試品溶液制成的內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值)，說明質量濃度為8.0 g/L及以下時的供試品不干擾細菌內毒素檢查。

表2 干擾試驗結果

2.6 樣品的細菌內毒素檢查

根據干擾試驗結果、細菌內毒素限值和最小有效稀釋濃度，取3批注射用還原型谷胱甘肽鈉(每批各取6支)，稀釋成質量濃度為4.0 g/L，分別使用廈門鱟試劑實驗廠和湛江安度斯生物有限公司生產的鱟試劑(靈敏度λ均為0.5 EU/mL)，按2010年版《中國藥典(二部)》附錄細菌內毒素檢查法檢查，結果全部呈陰性。

3 討論

細菌內毒素檢查是否可行的先決條件是，樣品在滿足限量檢查要求的質量濃度下對細菌內毒素試驗不產生干擾。如果樣品在高質量濃度時對細菌內毒素試驗不產生干擾，則在低質量濃度時也不產生干擾。在試驗中，首先按照最小有效稀釋濃度，將樣品配制成質量濃度分別為 4.0，2.0，1.0，0.5，0.25 g/L 的系列溶液，進行干擾預試驗，結果顯示均不干擾細菌內毒素的檢查，為了找出最大不干擾質量濃度，進一步對樣品質量濃度分別為64.0，32.0，16.0，12.0，8.0 g/L 的系列溶液進行干擾預試驗，初步判斷最大不干擾質量濃度為8.0 g/L。采用靈敏度 λ為0.5 EU/mL的鱟試劑對3個批號的樣品進行了干擾確證試驗，結果表明稀釋至8.0 g/L的樣品溶液對細菌內毒素檢查無干擾作用。因此，可以將注射用還原型谷胱甘肽鈉的細菌內毒素限值 L定為0.125 EU/mg，選擇市售任意靈敏度的鱟試劑(0.5～0.03 EU/mL)，將樣品稀釋到相應的質量濃度(4.0～0.25 g/L)進行細菌內毒素檢查[4]。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄ⅪE.

[2]張廣偉，周繼春.尼可剎米注射液細菌內毒素檢測法的建立[J].中國藥業，2010，19(6):32－33

[3]李 浩，李健和，葉 清.尼扎替丁氯化鈉注射液的細菌內毒素檢查[J].中國藥業，2009，18(4):38－39.

[4]蔡 彤，張國來，李 波，等.84種注射用藥品細菌內毒素檢查法的方法學研究[J].中國藥學雜志，2010，45(2):150 －155.