四季三黃片中黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的同時測定

彭 文，劉兆雄

(四川省德陽市食品藥品檢驗所，四川 德陽 618000)

四季三黃片是由大黃、黃芩、梔子、黃柏加工而成的中藥成方制劑，功能消炎退熱、通便利水，用于治療口鼻生瘡、咽疼牙痛、口干舌燥、目眩頭暈、大便秘結(jié)、小便赤黃[1]。方中黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血活血、安胎的功效，近年來發(fā)現(xiàn)黃芩根提取物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、抗氧化以及清除氧自由基、治療心血管疾病等作用[2];黃柏具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，用于治療濕熱瀉痢、黃疸帶下、熱淋、腳氣、瘺、骨蒸勞熱、盜汗遺精、瘡瘍腫毒、濕疹瘙癢[3]。黃芩苷和鹽酸小檗堿分別為黃芩和黃柏中的活性物質(zhì)，現(xiàn)行藥品標準中僅對方中大黃的有效成分大黃酸和大黃酚進行定量分析[1]，且現(xiàn)有文獻均分別對大黃酸和大黃酚、黃芩苷、梔子苷進行含量測定[4－7]。筆者采用反相高效液相色譜、梯度洗脫方法同時對四季三黃片中的黃芩苷和鹽酸小檗堿進行了含量測定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀，包括2487紫外檢測器、Empower色譜工作站;美國Varian Cary 100型紫外可見分光光度計。黃芩苷、鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110715－200815和110713－200609);四季三黃片(江西華太藥業(yè)有限公司，批號為090623，090630，090712);陰性對照藥材(德陽大中藥業(yè)公司)，質(zhì)量符合2005年版《中國藥典(一部)》規(guī)定;乙腈(上海陸都化學(xué)試劑廠)為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:A 為 2% 的三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié) pH=3.0)，B為乙腈，梯度洗脫(表1);柱溫:35℃;檢測波長:263 nm;柱溫:35℃;進樣量:10 μL。

表1 流動相洗脫梯度表

2.2 溶液制備

精密稱取黃芩苷對照品0.1123 g和鹽酸小檗堿對照品0.09921 g，分別置100 mL量瓶中，加70%乙醇適量使溶解后，加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液Ⅰ和對照品貯備液Ⅱ。取樣品適量，研細，精密稱取0.3015 g，置具塞錐形瓶中，加70%的乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，50℃超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加70%的乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取除黃芩外的其他處方量藥材，按質(zhì)量標準制備方法制成陰性對照樣品，取0.2836 g，按供試品溶液制備方法操作，即得陰性對照品溶液Ⅰ;另取除黃柏外的其他處方量藥材，按質(zhì)量標準制備方法制成陰性對照樣品，取0.2879 g，按供試品溶液制備方法操作，即得陰性對照品溶液Ⅱ。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗:精密量取兩種對照品貯備液5 mL，置50 mL量瓶中，加70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液Ⅰ、陰性對照品溶液Ⅱ，照上述色譜條件分別進樣。色譜圖見圖1。供試品溶液色譜中，有與對照品溶液色譜中黃芩苷和鹽酸小檗堿相對應(yīng)的色譜峰，且2個色譜峰之間的分離度及與其他色譜峰的分離度均大于1.5;陰性對照品溶液Ⅰ色譜中則無黃芩苷的色譜峰，陰性對照品溶液Ⅱ色譜中則無鹽酸小檗堿的色譜峰。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密量取對照品貯備液Ⅰ和對照品貯備液Ⅱ各 0.5，5.0，10.0，15.0，20 mL，分別置 5 個 50 mL 量瓶中，加 70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，照上述色譜條件測定，以進樣量(μg)對色譜峰面積(A)進行線性回歸，得回歸方程，黃芩苷為 A=1964615 C －113.5，r=0.9998(n=5)，鹽酸小檗堿為 A=3757220 C －1041.5，r=0.9999(n=5)。結(jié)果表明，黃芩苷和鹽酸小檗堿進樣量分別在 0.1123 ～2.2460 μg和 0.0992 ～1.984 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗:精密量取對照品貯備液Ⅰ和對照品貯備液Ⅱ各5 mL，置50 mL量瓶中，加70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液照上述色譜條件進樣5次。結(jié)果黃芩苷和鹽酸小檗堿平均峰面積分別為2206383和3727162，RSD分別為0.5%和0.6%(n=5)。

重現(xiàn)性試驗:取同一批樣品(批號為090623)6份，依法制備供試品溶液并測定。結(jié)果黃芩苷和鹽酸小檗堿色譜峰平均峰面積(折算為稱樣量0.3 g時的峰面積)為2444133和2018843，RSD分別為 0.7% 和 0.9%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，分別于0，2，6，12 h時進樣。結(jié)果3組樣品中黃芩苷和鹽酸小檗堿在各時間點的色譜峰峰面積的 RSD 值分別為 0.7% ，0.6% ，1.2% 和 0.3% ，1.1% ，1.0% ，表明供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足含量測定要求。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(批號為090623，標示質(zhì)量為 0.3 g，每片含黃芩苷 6.6310 mg、鹽酸小檗堿 2.6852 mg)6 份，每份約0.3 g，精密稱定，研細，置6個具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品貯備液Ⅰ和對照品貯備液Ⅱ1，1，5，5，10，10 mL，加 70%的乙醇100 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測定，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取樣品10片，研細，精密稱取適量(約0.3 g)，依法制備供試品溶液并測定含量。結(jié)果樣品批號為 090623，090630，090712的樣品中黃芩苷和鹽酸小檗堿含量分別為6.6310 mg/片和2.6852 mg/片，6.8251 mg/片和 2.6533 mg/片，6.9003 mg/片和 2.7013 mg/片(n=3)。

3 討論

精密量取對照品貯備液Ⅰ和對照品貯備液Ⅱ各1 mL，分別置2個100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度搖勻，濾過，分別取續(xù)濾液，于200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果黃芩苷對照品溶液在263 nm波長處有較大吸收，鹽酸小檗堿對照品溶液在263 nm波長處有最大吸收，且最大吸收波長處曲線平滑，故選擇263 nm作為測定波長。

試驗中流動相采用梯度洗脫，是為了讓各成分分離效果在較短的保留時間內(nèi)達到藥典規(guī)定，以避免時間過長降低檢測靈敏度。

[1]YBZ05432006，國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標準[S].

[2]吳冬莉，李 青，邱東平.淺談中藥黃芩的藥理作用[J].中華中西醫(yī)學(xué)雜志，2010(5):125－126.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:211.

[4]馮 看，楊 黎.HPLC測定四季三黃片中大黃素和大黃酚的含量[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，11(2):56－58.

[5]許江紅，張若良.HPLC法測定四季三黃片中黃芩苷的含量[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，18(6):13.

[6]黃叔章.RP－HPLC法測定四季三黃片中梔子苷的含量 [J].廣西中醫(yī)藥，2004，27(4):53 －54.

[7]卞艷晶，高延甲，王 建.四季三黃片質(zhì)量控制方法的研究[J].齊魯藥事，2010(1):24－26.