新生小鼠視網膜組織中MCP-1的表達變化及意義

(北京世紀壇醫院，北京 100038)

單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)是趨化因子家族中的主要成員之一，在腫瘤、炎癥、糖尿病視網膜病變等新生血管性疾病中，MCP-1起著重要的作用。它與血管內皮生長因子(VEGF)共同參與新生血管的形成［1］，VEGF 可通過激活核因子(NF)-κB、活化蛋白(AP)-1而誘導血管內皮細胞表達MCP-1［2］，而MCP-1可以作用于血管內皮細胞膜上的高親和受體CCR2，與G蛋白結合，趨化內皮細胞定向運動;同時MCP-1可趨化腫瘤相關巨噬細胞(TAM)進入組織，分泌VEGF等，間接刺激腫瘤新生血管生成。而許多致盲性視網膜疾病都與新生血管的產生有關。2010年6～7月，我們觀察了新生小鼠視網膜發育過程中MCP-1的表達，探討其在血管形成過程中的作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6J幼鼠(3、5、7、12、14、21日齡小鼠各10只)60只，雌雄不限，均為無特定病原體級(SPF級)，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法 將所有小鼠按日齡(3、5、7、12、14、21日)分別處死。立即摘除眼球，冰上分離視網膜，分別采用RT-PCR和Western blot法、免疫組化染色檢測MCP-1 mRNA和蛋白。①RT-PCR檢測:取部分視網膜組織，用Trizol試劑提取總RNA，RNA定量后參照文獻［3］的方法，用一步法 PCR試劑盒。MCP-1上游引物:5'-CTGGACCCAACTGCAACTGCTT-3'，MCP-1 下游引物:5'-ACTGGCCTTCGGTTTCCTTATC-3'，擴增片段 544 bp;β-actin 上游引物:5'-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3'，β-actin 下游引物:5'-TCCAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-3'，擴增片段316 bp。合成 cDNA，PCR擴增過程:55℃、30 min，預變性94℃、2 min，變性94 ℃、15 s，退火57 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，后延伸72℃、10 min，共35個循環。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用圖像分析儀進行圖像分析。所得結果與β-actin的比值為MCP-1 mRNA相對表達量。每樣品實驗重復3次，取均值。②Western blot檢測:取部分視網膜組織，提取總蛋白，參照文獻［3］，將定影后的X線膠片用JVCKy-F30B圖像攝錄輸入儀掃描，KONTRONIBAS2.0全自動圖像分析系統(德國Koutron公司)進行半定量分析。所得結果與內參照GAPDH的比值為MCP-1蛋白相對表達量。每樣品實驗重復3次，取其均值。③免疫組化SP染色:取部分視網膜組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，5～7 μm厚切片。采用免疫組化SP法染色。按試劑盒(福州邁新生物技術開發公司)說明書操作，一抗為單克隆小鼠抗小鼠MCP-1抗體，由美國Santa Cruz公司提供。結果判定標準:細胞質呈棕黃色或黃色為陽性結果。采用Olympus熒光照像顯微鏡照相，用圖像分析軟件(Image-Pro Plus，version 4.5 for Windows)分析陽性細胞平均OD值。

2 結果

3日齡小鼠視網膜內核層和節細胞層即有MCP-1蛋白表達(陽性細胞平均OD值為0.083±0.007)，隨著視網膜血管的發育，12日齡時MCP-1蛋白陽性細胞明顯增多，陽性細胞平均OD值為0.199±0.015(P ＜0.05)，其他日齡時 MCP-1 蛋白陽性細胞數呈基線表達。

不同日齡小鼠視網膜組織中MCP-1 mRNA、蛋白表達結果見圖1。MCP-1 mRNA和蛋白在3日齡小鼠視網膜組織中即有表達，12日齡時呈現一過性高表達(P＜0.05)，之后迅速下降，21日齡時表達基本呈基線水平。

圖1 不同日齡小鼠視網膜組織中MCP-1 mRNA、蛋白表達

3 討論

研究表明小鼠等嚙齒類哺乳動物的視網膜血管在出生后才開始由視盤發育，同時玻璃體血管退化，12日齡時視網膜淺層血管發育完全，玻璃體血管完全退化［4］，并可以通過眼底鏡和熒光血管造影觀察其發育過程［5］，因此小鼠成為研究血管形成的理想動物模型。

MCP-1是單核細胞趨化的重要趨化因子，為76個氨基酸殘基構成的肽段，可由單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等產生，其受體為CCR2，分布在單核細胞、嗜堿性粒細胞和樹突狀細胞膜上，是一類含7個跨膜區的G蛋白偶聯受體超家族(GPCRs)，胞內區與 G蛋白偶聯。當 MCP-1與CCR2結合后，受體變構與G蛋白結合，胞內Ca2+內流增加、激活磷脂酶 C以及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)等多種激酶，在其信號傳導中發揮作用［6］。

研究表明MCP-1具有趨化單核細胞和T淋巴細胞聚集并激活單核細胞和巨噬細胞的作用，不僅是參與炎癥的重要因子，還參與正常血管發育和病理性新生血管形成［2］。小鼠的視網膜血管在出生后開始由視盤發育，同時玻璃體血管開始退化。本研究顯示，新生小鼠視網膜組織中MCP-1的表達變化與文獻［5］報道的小鼠視網膜發育過程相吻合，在出生后第3天的小鼠視網膜組織中即可檢測到MCP-1;生后第7天小鼠玻璃體動脈退化的程度最大，視網膜血管部分發育［5］，生后第7天小鼠視網膜組織中MCP-1表達較第3天時略高;12日齡小鼠視網膜淺層血管發育完全，玻璃體血管完全退化，而此時視網膜組織中MCP-1的表達達到高峰;隨著視網膜血管的發育成熟，MCP-1的表達逐漸降低，在14、21日齡呈基線表達。

有研究發現［7，8］，在許多以血管生成為特點的疾病中，MCP-1表達增高。①MCP-1直接作用于血管內皮細胞膜上的CCR2，趨化內皮細胞定向運動，促進血管形成;②MCP-1趨化血管平滑肌細胞和間質細胞向內皮細胞運動，促進TGF-β的分泌，對血管生成起中介作用。本實驗發現，在無炎癥情況下，MCP-1在小鼠的視網膜血管發育過程中的視網膜組織中均有表達，且表達量與視網膜血管發育的成熟程度和生長速度同步，間接證明了MCP-1與小鼠視網膜發育有關，對視網膜血管的發育起作用。

［1］Yamada M，Kim S，Egashira K，et al.Molecular mechanism and role of endothelial monocyte chemoattractant protein-1 induction by vascular endothelial growth factor［J］.Arterioscler Thromb Vasc Bio，2003，23(18):1996-2001.

［2］Fujii T，Yonemitsu Y，Onimaru M，et al.Nonendothelial mesenchymal cell-derived MCP-1 is required for FGF-2-mediated therapeutic neovascularization:critical role of the inflammatory/arteriogenic pathway［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(11):2483-2489.

［3］Chu L，Li X，Yu W，et al.Expression of fractalkine(CX3CL1)and its receptor in endotoxin-induced uveitis［J］.Ophthalmic Res，2009，42(3):160-166.

［4］Ashton N.Some aspects of the comparative pathology of oxygen toxicity in the retina［J］.Ophthalmologica，1970，160(1):54-71.

［5］Larrazabal LI，Penn JS.Fluorescein angiography of the newborn rat，implications in oxygen-induced retinopathy［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1990，31(5):810-818.

［6］Cambien B，Pomeranz M，Millet MA，et al.Signal transduction involved in MCP-1-mediated monocytic transendothelial migration［J］.Blood，2001，97(2):359-366.

［7］Salcedo R，Ponce ML，Young HA，et al.Human endothelial cells express CCR2 and respond to MCP-1:directrole of MCP-1 in angiogenesis and tumor progression［J］.Blood，2000，96(1):34-40.

［8］Ma J，Wang Q，Fei T，et al.MCP-1 mediates TGF-beta-induced angiogenesis by stimulating vascular smooth muscle cell migration［J］.Blood，2007，109(3):987-994.