人參皂甙Rh2對人腦膠質瘤細胞株U251凋亡的影響及機制探討

春，黎鐵偉繼全

(遼寧醫學院，遼寧錦州121001)

人參皂苷Rh2(GS-Rh2)是從人參中提取的一種天然活性成分。國外研究表明［1］，GS-Rh2的抗腫瘤作用較為廣泛，在腫瘤的預防和治療方面具有較強的活性，具有抑制腫瘤的生長和誘導癌細胞凋亡的作用。目前國內研究相對較少。2010年6～11月，為了探討GS-Rh2對腫瘤細胞的可能作用機制，我們以人腦膠質瘤細胞株U251為實驗材料，觀察GS-Rh2對U251凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 U251(購于中科院上海細胞庫)，GS-Rh2(購于吉林宏久生物科技有限公司)，DMEM 培養基，胎牛血清，MTT、DMSO、DNA Marker DL2000、Taq DNA聚合酶、流式雙染試劑盒、RTPCR試劑盒(大連寶生物公司產品)，Trizol、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體、Bcl-2鼠單抗(美國GBICO公司)。酶聯免疫檢測儀、流式細胞儀、多功能電泳儀，PCR儀，Biorad凝膠成像系統。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 按常規方法在培養瓶中培養U251，用含10% 胎牛血清的DMEM完全培養液置于37℃，5%CO2培養箱培養。取對數生長期細胞檢測。

1.2.2 細胞增殖抑制率測算 采用MTT法。取對數生長期U251接種于96孔培養板(1×104/孔)，加入配制好的GS-Rh2(加藥組)，使其終濃度分別為5、10、20、40、80 μg/ml(以不加 GS-Rh2 者為對照組)，每孔設4個復孔，用新鮮培養基補充至每孔100 μl，37 ℃、5%CO2孵箱中培養 48 h 后，改用不加胎牛血清的培養基繼續培養4 h，加入MTT液(5 mg/ml)20 μl。檢測波長為570 nm處的吸光值(A值)。細胞抑制率=(1－加藥組A值/對照組A值)×100%。通過細胞增殖抑制曲線求出抑制率(IC)為 IC30、IC50、IC70值時的 GS-Rh2 濃度。

1.2.3 細胞凋亡率檢測 收集 IC30、IC50、IC70的GS-Rh2作用48 h后的U251，采用Annexin V-FITC/PI雙標記檢測，用流式細胞術觀察細胞凋亡情況。

1.2.4 U251 中 Bcl-2、Caspase-3 mRNA 及蛋白檢測①U251中Bcl-2、Caspase-3 mRNA檢測:采用RTPCR技術。分別收集對照組和加藥組(IC50)處理12、24、48、72 h 的細胞，按 Trizol試劑盒說明書分別提取細胞中總RNA，逆轉錄制備 cDNA，產物進行PCR。Bcl-2 引物序列:上游:5＇-AAC TCG AGT GAC AAG CCC GTA G-3 ＇，下 游:5 ＇-GTA CCA CCA GTT GGT TGT CTT TGA-3＇，預期擴增片段長度133 bp;Caspase-3引物序列:上游:5＇-AGA CTG ACT GGA AAG CCG AA-3＇，下游:5＇-CGG GAT CTG TTT CTT TGC AC-3＇，預期擴增片段長度342 bp;β-actin 引物序列:上游:5＇-GGC ATG GGT CAG AAG GAT TCC-3＇;下游 5＇-ATG TCA CGC ACG ATT TCC CGC-3＇，預期擴增片段長度500 bp。反應條件:94℃ 5 min后進入下列循環:94 ℃ 30 s、62 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，共39個循環，72℃延伸7 min后終產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳，成像拍照，用Gene Tools圖像分析軟件分析。各組細胞中Bcl-2、Caspase-3與β-actin基因條帶灰度比為其mRNA半定量表達水平。②U251中Bcl-2、Caspase-3蛋白檢測:采用Western blot法。將對數生長期細胞換液加入IC50的GS-Rh2，分別作用 0、12、24、48、72 h，裂解細胞，提取細胞總蛋白，電泳分離。以β-actin為內對照。Bcl-2/β-actin、Caspase-3/β-actin分別為 Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。數據用xˉ±s表示，兩樣本均數比較采用獨立樣本配對t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GS-Rh2對U251增殖的影響 對照組細胞無生長抑制;給藥組中給予 5、10、20、40、80 μg/ml的GS-Rh2作用后，U251生長抑制率分別為19.34%、33.09%、46.28%、58.37%、72.91%;兩組比較，P ＜0.05，其細胞生長抑制呈劑量依賴關系(P均 ＜0.05)。根據細胞增殖抑制曲線求得 IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用濃度分別為 10.6、22.3、70.2 μg/ml。

2.2 兩組細胞凋亡情況 對照組細胞凋亡率為3.85%，IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用 48 h 時 U251凋亡率分別為 20.37%、49.39%、70.82%，兩組比較，P＜0.05。隨藥物濃度的增加，細胞凋亡率升高(P 均 ＜0.05)。

2.3 U251中 Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達變化成功獲得 Bcl-2 mRNA 133 bp、Caspase-3 mRNA 342 bp。兩組細胞中Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達水平見表1。

表1 兩組不同時點細胞中Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達量比較(±s)

表1 兩組不同時點細胞中Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別Bcl-2 mRNA Caspase-3 mRNA對照組0.968 1 ±0.005 1 0.322 9 ±0.001 7給藥組12 h 0.890 7 ±0.004 1 0.401 8 ±0.001 5 24 h 0.763 2 ±0.004 3* 0.744 9 ±0.004 2*48 h 0.431 9 ±0.001 4* 0.884 1 ±0.004 4*72 h 0.357 8 ±0.001 8* 0.976 4 ±0.004 9*

2.4 U251中 Bcl-2、Caspase-3蛋白表達變化 隨GS-Rh2作用時間的延長，U251中Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低、Caspase-3蛋白表達明顯增高。見表2。

表2 兩組不同時點細胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達量比較(±s)

表2 兩組不同時點細胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別 Bcl-2蛋白 Caspase-3蛋白對照組0.82 ±0.02 0.27 ±0.06給藥組12 h 0.72 ±0.02 0.39 ±0.01 24 h 0.62 ±0.02* 0.59 ±0.02*48 h 0.40 ±0.05* 0.69 ±0.02*72 h 0.29 ±0.02* 0.81 ±0.02*

3 討論

目前手術切除是腦膠質瘤主要的治療手段，但臨床遠期療效不理想。大量研究表明，GS-Rh2在腫瘤的預防和治療方面具有較強活性，Rh2對多種腫瘤細胞如小鼠黑色素瘤B16細胞、C6膠質瘤細胞、人肝癌細胞SK-HEP-1等具有增殖抑制和誘導凋亡作用［2］;Rh2可以從誘導細胞凋亡、誘導細胞分化、抑制腫瘤DNA合成、提高機體免疫功能等各方面發揮抗腫瘤作用［3］。GS-Rh2的抗腫瘤作用較為廣泛，既可阻滯細胞周期，誘導癌細胞凋亡和抑制腫瘤的生長或誘導細胞分化使其逆轉，抑制腫瘤的轉移;又可調節機體免疫功能，增強機體對疾病的抵抗能力;還可增強抗癌藥的藥效。

細胞凋亡是一極其復雜的生物學過程，是細胞在各種死亡信號刺激后發生的一系列瀑布式激活的主動性死亡過程，它受多種基因調控，其中Bcl-2是最為重要的抑制細胞凋亡的基因。Bcl-2高表達的細胞存活時間明顯地延長［4］，其主要通過產生抗氧化劑或抑制氧自由基而抑制細胞凋亡［5］，是細胞凋亡的關鍵性調節因子［6］。

細胞凋亡過程還與 Caspase家族密切相關［7，8］。Caspase-3是目前發現的Caspase家族中引起細胞凋亡的關鍵性酶，也是參與細胞凋亡的主要成分。有研究結果表明［9，10］，通過抑制 Caspase-3 基因活性或拮抗其功能可使細胞凋亡受抑，細胞可無限增殖，因此Caspase-3對于調控細胞凋亡起重要作用。

本研究結果顯示，GS-Rh2對U251有增殖抑制作用，且隨著GS-Rh2藥物濃度的增加，細胞受抑制程度明顯增強。根據細胞增殖抑制曲線求得IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用濃度分別為 10.6、22.3、70.2 μg/ml。在 IC50的 GS-Rh2 作用 48 h 后，U251呈明顯的抑制增殖。流式細胞術檢測細胞凋亡率證實，IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用48 h 時 U251 凋亡率分別為 20.37%、49.39%、70.82%，且隨藥物濃度的增加，細胞凋亡率升高(P＜0.05)。證實GSRh2可抑制人腦膠質瘤細胞株U25l的增殖，可以導致細胞凋亡率的增加，表明GS-Rh2在膠質瘤治療中將具有一定的療效。

我們通過RT-PCR及Western blot技術檢測發現，U251經IC50的GS-Rh2處理后，自處理后的24 h開始 Bcl-2 mRNA、蛋白表達水平逐漸降低，Caspase-3 mRNA、蛋白表達水平逐漸增高，表明GSRh2誘導U251凋亡作用與下調細胞中Bcl-2表達、上調Caspase-3表達有關。

通過研究我們認為，Gs-Rh2是一種天然的抗腫瘤藥物，對于臨床腫瘤的治療可發揮重要作用。

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