GDF5基因啟動子表達載體的構建

旭，孫立勝，史冬泉，

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院，南京 210008)

生長分化因子5(GDF5)，又稱軟骨來源形成蛋白1，屬骨形態發生蛋白(BMP)家族，也是轉化生長因子 β(TGF-β)超家族成員之一［1］，是骨骼系統的主要調節因子，在骨骼發育過程中對軟骨內成骨，骨與關節的形成起著重要作用［2］。2010年1～12月，我們采用PCR技術成功構建含GDF5基因表達載體pGL3-GDF5。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 載體pGL3-Basic，大腸桿菌DH10b感受態細胞(南京大學模式動物研究所高翔實驗室饋贈)，高保真酶Primer Star，dNTP，T4連接酶，限制性內切酶BglⅡ、HindⅢ(大連寶生物工程有限公司)，基因組DNA抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒(Promega公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計及合成 根據GDF5的GenBank中NM000557檢索序列，設計一對特異性引物(上海英駿生物技術有限公司合成)，5'端分別加入BglⅡ、HindⅢ酶切位點。上游引物序列:5'-GAAGATCTCT GGAAAGGATTCAAAACTAGGG-3'，下游引物序列:5'-CCCAAGCTTGGGGACAGATCCTGCTTT-3'。

1.2.2 基因組DNA提取 用基因組DNA抽提試劑盒提取健康人外周血基因組DNA，作為PCR擴增模板。

1.2.3 PCR 擴增 PCR 反應體系50 μl，反應參數:94℃預變性3 min后，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環，于72℃延伸5 min。將PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，按DNA凝膠回收試劑盒說明書純化回收。

1.2.4 重組質粒pGL3-GDF5的構建 分別用限制性內切酶 BglⅡ和 HindⅢ對回收的 PCR產物和pGL3-Basic載體質粒進行雙酶切，按照DNA凝膠回收試劑盒說明，切膠純化酶切后的pGL3-Basic載體質粒大片段和GDF5基因啟動子片段，在T4連接酶的作用下，將兩者16℃連接過夜。將連接產物轉化到大腸桿菌DH10b感受態細胞，菌液均勻涂布于含有氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37℃培養箱中培養12 h，隨機挑取2個陽性克隆，置于LB/Amp液態培養基中震蕩培養12 h，根據質粒提取試劑盒說明書，提取質粒DNA(pGL3-GDF5)，BglⅡ和HindⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，同時菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

2 結果

2.1 GDF5基因擴增結果 通過上、下游引物進行PCR擴增后，得到1條長度為854 bp的PCR產物，見圖1。

圖1 GDF5基因PCR產物電泳結果

2.2 重組質粒pGL3-GDF5連接后鑒定結果 挑選陽性克隆菌落，PCR鑒定結果所產生的結果見圖2。pGL3-Basic質粒大片段為4 801 bp，如插入854 bp外源基因GDF5啟動子，其擴增長度應為兩者之和(約5 655 bp)，證明兩者連接成功。

圖2 質粒連接后鑒定結果

2.3 重組質粒雙酶切及測序鑒定 重組質粒載體pGL3-GDF5經BglⅡ和HindⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示出4 801 bp的大片段和854 bp的小片段，與理論結果相符，證明質粒構建成功，見圖3。雙向測序結果與GenBank中GDF5序列完全匹配。

3 討論

圖3 重組質粒雙酶切電泳結果

GDF5是一種分泌性多功能蛋白［3］。研究發現GDF5是一種在胚胎肢體發育尤其是軟骨與關節形成中扮演關鍵角色的調節因子，在機體軟骨形成及發育中的作用受到人們的關注。首先GDF5能夠促進間充質細胞在關節將要形成的部位聚集，這是軟骨形成的最初步驟;后期主要是促進間充質細胞向成軟骨細胞分化，刺激軟骨細胞增生、肥大［4～7］。

關節軟骨損傷的修復是臨床治療中的難點［8］。由于關節軟骨的不可再生性，一旦發生損傷，嚴重影響肢體關節功能。目前，GDF5在一些試驗中對于關節軟骨損傷的修復作用已經得到了證實［9，10］。體外試驗也表明GDF5能夠增強軟骨細胞聚集、誘導軟骨分化并促進其成熟［11］。可見探討軟骨損傷、修復過程的分子機制將對臨床骨性關節炎的治療有極大影響。

pGL3-Basic載體不含啟動子及增強子，通過將啟動子序列克隆到熒光素酶基因的上游，即可測定其是否具有啟動熒光素酶基因表達的活性。與其他檢測系統相比，熒光素酶檢測系統具有非放射性、半衰期較短、操作簡單、結果直觀、靈敏度高等優點。因而適合對基因瞬時表達的研究，是研究轉錄調控基因的一種理想的報告基因載體。研究表明質粒pGL3-Basic的多克隆位點中含的BglⅡ和HindⅢ內切酶位點，在設計擴增目的片段的上下游引物中加上同樣的雙酶切位點，這樣在構建重組表達質粒的連接中就可以使目的片段按正確的方向插入載體中，即定向克隆。

本實驗采用RT-PCR方法合成GDF-5啟動子基因，并插入到質粒pGL3-Basic上，經過酶切鑒定和測序證實表達載體pGL3-GDF5構建成功，為進一步研究GDF5在軟骨發育及分化中的作用機制提供直接的實驗依據，為體外誘導軟骨形成提供實驗基礎，為將來用于臨床治療骨關節軟骨損傷開拓了思路。

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