人參皂苷Rg3對乳腺癌細胞增殖的影響及其機制探討

(1山東省立醫院，濟南 250021;2山東大學醫學院)

目前對乳腺癌的治療主要采用手術、化放療等綜合治療。傳統化療藥物多存在選擇性差、毒性作用大、易發生耐藥等問題。研究開發新的化療輔助藥物對于提高療效，減輕患者痛苦具有重要意義。人參作為我國傳統的名貴中藥材，具有多種生物活性。已證實多種人參皂苷單體如Rh、Rg等均具有抗腫瘤作用，但其確切機制尚未明了。2010年1月～2011年1月，我們觀察了人參皂苷Rg3對雌激素受體(ER)陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖的影響。現報告如下并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人參皂苷Rg3(中國藥品生物制品檢定所)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(Santa Cruz，USA)，辣根過氧化物酶(HPR)標記二抗(北京中衫金橋生物技術有限公司)，DMEM培養基(GIBCO，USA)，胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)。超敏化學發光(ECL)試劑盒(Amersham Biosciences，USA)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質定量試劑盒(碧云天生物技術有限公司)。

1.2 人參皂苷Rg3溶液制備及細胞培養 人參皂苷Rg3干粉用二甲亞砜(DMSO)溶解為100 mg/ml，備用;MDA-MB-231購自上海細胞所，細胞培養于含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml的DMEM培養基中，37℃恒溫培養，生長至80%～90%融合后傳代，隔天換液1次。

1.3 細胞分組及細胞活力檢測 取對數生長期的MDA-MB-231，按2 000/孔的密度接種于96孔板，培養24 h后加藥。每組設4個復孔，分別加入終濃度為50、100、200、400、600 μmol/L 人參皂苷 Rg3(為實驗組)，設不加藥物的細胞為對照組。采用MTT法測算兩組細胞存活率。兩組分別于孵育24、48、72 h后每孔加MTT(5 g/L)20 μl，繼續孵育4 h后棄培養液，加入DMSO 150 μl/孔混勻，酶標儀(波長570 nm)測定各孔OD值。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.4 細胞中Cyclin E及CDC25A檢測 收集兩組細胞，提取總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，按試劑盒說明書操作。取蛋白樣品40 μg，適量上樣緩沖液混勻，100℃變性5 min，用5%積層膠、10%分離膠的SDS-PAGE電泳后，采用Western blot法檢測細胞內Cyclin E、CDC25A。用凝膠圖像分析系統對Western blot反應陽性條帶進行積分光密度(IOD)測定，以Cyclin E、CDC25A IOD值與對應的GAPDH IOD值的比值代表其相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0軟件。計量資料以±s表示，用t檢驗。P≤0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷Rg3對MDA-MB-231細胞存活率的影響 50～200 μmol/L的人參皂苷Rg3，具有促進MDA-MB-231增殖作用，促增殖能力與藥物濃度成正比(P 均 ＜0.01);400～600 μmol/L的人參皂苷Rg3則抑制細胞增殖，其抑制能力與藥物濃度成正比(P均＜0.01)。詳見表1。

表1 實驗組中不同濃度人參皂苷Rg對MDA-MB-231細胞存活率的影響(%，±s)

表1 實驗組中不同濃度人參皂苷Rg對MDA-MB-231細胞存活率的影響(%，±s)

人參皂苷Rg3濃度(μmol/L)MDA-MB-231細胞存活率24 h 48 h 72 h 50 108.65 ±0.92 122.71 ±1.35 141.43 ±1.06 100 115.81 ±1.68 127.45 ±0.71 148.68 ±1.55 200 109.52 ±1.43 123.53 ±1.02 133.68 ±1.84 400 68.13 ±1.76 73.37 ±0.96 80.36 ±1.53 600 57.91 ±2.01 65.25 ±1.78 66.96 ±2.19

2.2 兩組細胞中Cyclin E、CDC25A表達水平比較50～200 μmol/L的人參皂苷Rg3，上調MDA-MB-231內Cyclin E、CDC25A表達，并與其藥物濃度呈正比(P 均 ＜0.01);400～600 μmol/L的人參皂苷Rg3則抑制Cyclin E、CDC25A表達，其抑制能力與藥物濃度成正比(P均＜0.01)。詳見表2。

表2 兩組MDA-MB-231內Cyclin E、CDC25A相對表達量比較( ±s)

表2 兩組MDA-MB-231內Cyclin E、CDC25A相對表達量比較( ±s)

組別Cyclin E CDC25A對照組1.035 ±0.032 0.511 ±0.017實驗組50 μmol/L 1.078 ±0.049 0.586 ±0.009 100 μmol/L 1.101 ±0.016 0.595 ±0.014 200 μmol/L 1.113 ±0.027 0.597 ±0.011 400 μmol/L 0.644 ±0.037 0.384 ±0.007 600 μmol/L 0.482 ±0.039 0.353 ±0.013

3 討論

已有研究證實，人參皂苷類藥物可以抑制腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡，對化療藥效有增強作用［1］;動物實驗也發現人參皂苷可以抑制小鼠體內卵巢癌的生長和癌細胞增殖［2］。人參皂苷Rg3是一種四環三萜皂苷，其抗腫瘤作用已經引起廣泛重視，但是確切機制尚未明了。

本研究結果顯示，低濃度(≤200 μmol/L)人參皂苷Rg3，對MDA-MB-231增殖具有促進作用，其促增殖能力與藥物濃度成正比(P均＜0.01);高濃度(≥400 μmol/L)人參皂苷Rg3則抑制細胞增殖，其抑制能力與藥物濃度成正比(P均＜0.01)。對細胞周期相關蛋白的檢測發現，與對照細胞比較，低濃度人參皂苷Rg3可上調MDA-MB-231內Cyclin E、CDC25A表達，高濃度人參皂苷Rg3則抑制Cyclin E、CDC25A表達。人參皂苷 Rg3對 MDA-MB-231細胞內Cyclin E、CDC25表達水平的影響與其對細胞存活率的影響趨勢一致，提示Rg3可能通過調節細胞周期影響腫瘤細胞的增殖。

Cyclin E主要在細胞G1～S期表達，通過結合并激活細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK)2，形成Cyclin E-CDK2復合物，調節細胞G1、S期的過渡。Cyclin E過量表達可持續性激活CDK2，進而促進視網膜神經膠質瘤蛋白磷酸化，細胞發生異常增殖［3］。目前已經在多種類型腫瘤中發現了 Cyclin E-CDK2的表達異常和功能失調，表現為Cyclin E的表達與細胞周期不同步，且表達水平顯著高于生理水平［4～6］。通過藥物抑制 Cyclin E的表達，可以造成細胞G1期阻滯，抑制腫瘤細胞增殖。

CDC25A是雙重特異性磷酸酶家族的重要成員，主要在G1中晚期表達，通過催化CDK去磷酸化促使細胞發生 G1、S轉換并進入 S期［7］。CDC25A參與G2、M期轉換，是重要的細胞周期調控因素之一［8］。CDC25A在結腸癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤均呈過度表達，通過抑制CDC25A的表達抑制腫瘤進展是乳腺癌治療的一個新方向［9］。

綜上所述，高濃度人參皂苷Rg3對人乳腺癌MDA-MB-231的增殖具有抑制作用，此作用與影響細胞周期相關蛋白Cyclin E、CDC25的表達，導致細胞周期停滯于G1或G2期有關。人參皂苷Rg3的抑瘤作用研究還需利用動物模型進行體內實驗，其影響細胞周期調控的相關信號通路尚需進一步深入研究。

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