肝癌組織中ZHX2基因啟動(dòng)子甲基化及其與臨床病理特征的關(guān)系

田曉豐 趙紅蕾 孫月芳 曹 宏 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院普外科中心，吉林 長(zhǎng)春 3004)

ZHX2是ZHX(zinc-fingers and homeoboxes)蛋白家族成員之一，是2003年新克隆得到的轉(zhuǎn)錄抑制因子，位于染色體8q24.13，含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和5個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，其編碼的蛋白含837個(gè)氨基酸殘基，定位于細(xì)胞核內(nèi)〔1〕。近年來(lái)的研究結(jié)果顯示，ZHX2參與正常肝細(xì)胞中肝癌標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄抑制，提示ZHX2的表達(dá)缺失可能是肝細(xì)胞癌發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。目前研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞中存在異常甲基化的DNA，其中一個(gè)甲基化DNA片段為ZHX2。提示ZHX2基因啟動(dòng)子甲基化為其在HCC中呈低表達(dá)的主要原因之一，進(jìn)一步表明ZHX2基因與HCC發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系〔2〕。啟動(dòng)子的高甲基化被認(rèn)為是人類(lèi)癌癥的標(biāo)志，同時(shí)也是導(dǎo)致基因失活的常見(jiàn)機(jī)制。然而受限于寡核苷酸雜交序列或者酶切位點(diǎn)等原因，許多方法比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，或提供的信息有限，不能夠應(yīng)用于大量序列或樣本的檢測(cè)。本研究通過(guò)亞硫酸氫鈉變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)檢測(cè)HCC中ZHX2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況，并分析其與HCC臨床病理特征的關(guān)系，以探討ZHX2基因在HCC的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 24例HCC及癌旁肝組織和6例膽管結(jié)石手術(shù)切除的正常肝組織均來(lái)自2009～2010年吉林大學(xué)第二醫(yī)院手術(shù)標(biāo)本。所有研究對(duì)象均有知情同意權(quán)。標(biāo)本于手術(shù)摘除后5 min內(nèi)采集，生理鹽水沖洗后立即液氮保存，腫瘤標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)切片證實(shí)為HCC。

1.2 儀器和試劑 DHPLC儀為美國(guó)Transgenomic公司W(wǎng)AVE?，Transgenomic Inc.，Cambridge，MA;DHPLC 分離柱:DNASep@Cartridge DNA-99-3510;洗脫液A:0.1 moL/L TEAA，0.025%ACN;洗脫液 B:0.1 mol/L TEAA，25%CAN;Master cycler PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司);dNTP(德國(guó)Qiagen公司)，Taq酶(匹基生物工程有限公司)。低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠為Invitrogen Inc.，Carlsbad，CA產(chǎn)品;QIA quick膠提取試劑盒為Qiagen，Valencia，CA 產(chǎn)品;EA DNA Methylation-gold Kit為 Zemo Research公司試劑盒;體外甲基化的DNA(Chemicon International，Temecula，CA)作為甲基化的陽(yáng)性對(duì)照，人類(lèi)胎盤(pán)DNA(Sigma，St.Louis，MO)作為甲基化的陰性對(duì)照。亞硫酸氫鹽修飾前配制甲基化/未甲基化的DNA溶液。

1.3 基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化分析

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 預(yù)測(cè)ZHX2啟動(dòng)子區(qū)CG二核苷酸富集區(qū)，并根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物，上游引物:5'-TTTTAAAATCGTTATTATTATTTT-3'，下游引物 5'-ATTTTCTTTATGAAAAGTTCAA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度240 bp。

1.3.2 亞硫酸鹽處理及啟動(dòng)子區(qū)域目的片段擴(kuò)增 按照EA DNA Methylation-gold Kit說(shuō)明書(shū)，對(duì)基因組DNA，進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理，將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。PCR反應(yīng)體系為50 μl，包括模板 DNA 5 μl、dNTP 4 μl、10 × PCR 緩沖液5 μl、10 μmol/L的上 下 游 引 物 各 1 μl、HotStar Taq DNA 聚 合 酶0.25 μl、ddH2O 34.75 μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 5 min;94℃30 s，54℃ 30 s，72℃ 20 s，35 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min;4℃保存。

1.3.3 DHPLC 對(duì)PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行DHPLC分析。DHPLC使用自動(dòng)化DHPLC儀器，用Transgenomic DNASep?色譜柱進(jìn)行。樣品用2%的洗脫液B線(xiàn)性梯度洗脫，buffer B起始濃度為40%，以0.9 ml/min的流速檢測(cè)12 min，紫外檢測(cè)器在260 nm處進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品的部分變性溫度根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同使用WAVE Navigator軟件確定。根據(jù)樣品中靶序列的保留時(shí)間確定甲基化狀態(tài)。

1.3.4 亞硫酸氫鹽處理后測(cè)序 用2%的低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，切膠回收用QIA quick膠提取試劑盒純化。使用BigDye Terminator v3.1循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)測(cè)序，按說(shuō)明書(shū)步驟操作。測(cè)序產(chǎn)物使用 DyeEx spin columns(Qiagen，Valencia，CA)純化。DNA 沉淀使用 10 μl HiDi甲酰胺(Applied Biosystems，UK)重懸，轉(zhuǎn)移至96孔光學(xué)反應(yīng)板內(nèi)并用隔板封閉(所有部件來(lái)自Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。序列使用 ABI PRISM 3100自動(dòng) DNA序列檢測(cè)系統(tǒng)(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS10.0對(duì)兩樣本率的比較使用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 DHPLC檢測(cè)ZHX2啟動(dòng)子甲基化方法的建立 啟動(dòng)子通用PCR產(chǎn)物，在50℃非變性條件下進(jìn)行雙鏈DNA片段長(zhǎng)度測(cè)定，發(fā)現(xiàn)它們的保留時(shí)間完全相同。在55℃條件下按檢測(cè)突變方式進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)甲基化PCR產(chǎn)物保留時(shí)間為5.6 min，而非甲基化PCR產(chǎn)物保留時(shí)間為5.4 min。將兩種PCR產(chǎn)物混合后，則能夠在5.4 min和5.6 min各檢測(cè)到一個(gè)相互獨(dú)立的色譜峰。表明所建立的方法正確，可以用于下一步HCC樣本的檢測(cè)。見(jiàn)圖1。

2.2 DHPLC檢測(cè)樣品ZHX2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平 膽管結(jié)石手術(shù)切除患者的正常肝組織中均可見(jiàn)保留時(shí)間為5.4 min的非甲基化色譜峰(圖2)，未檢測(cè)到ZHX2基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化。對(duì)24例不同等級(jí)的肝癌組織的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有11例可在5.6 min處檢測(cè)到甲基化峰(圖2)，甲基化陽(yáng)性率為45.8%。另外，在24例癌旁肝組織檢測(cè)到3例甲基化，甲基化陽(yáng)性率為16.6%，明顯低于癌組織。

2.3 ZHX2啟動(dòng)子甲基化與HCC臨床病理特征的關(guān)系

ZHX2啟動(dòng)子甲基化發(fā)生情況與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分化程度無(wú)顯著相關(guān)性，但與血清AFP值及是否轉(zhuǎn)移有關(guān)。見(jiàn)表1。

圖1 ZHX2啟動(dòng)子區(qū)甲基化和非甲基化PCR產(chǎn)物色譜圖

圖2 部分組織標(biāo)本ZHX2啟動(dòng)子區(qū)甲基化DHPLC測(cè)定色譜圖

表1 ZHX2啟動(dòng)子甲基化與HCC臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

3 討論

啟動(dòng)子的高甲基化被認(rèn)為是人類(lèi)癌癥的標(biāo)志，同時(shí)也是導(dǎo)致基因失活的常見(jiàn)機(jī)制。越來(lái)越多學(xué)者認(rèn)為HCC是基因病，必須從探明HCC發(fā)病的分子機(jī)制入手才能從根本上控制HCC的發(fā)生和發(fā)展〔3〕。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)HCC發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了飛躍。目前普遍認(rèn)為HCC的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多步驟逐漸演變的復(fù)雜過(guò)程，涉及多組基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的變化，包括原癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活等改變〔4〕。DNA甲基化是一種影響基因表達(dá)的機(jī)制，只引起基因表達(dá)異常，并不改變DNA本身的序列和基因產(chǎn)物，所以這種改變是可逆的。因此，運(yùn)用甲基化抑制劑使甲基化的腫瘤抑制基因去甲基化，重新發(fā)揮抑制腫瘤的功能，就有可能成為一種新的腫瘤治療途徑〔5〕。

本研究利用DHPLC方法，針對(duì)ZHX2基因啟動(dòng)子重要區(qū)域，建立了甲基化定量分析標(biāo)準(zhǔn)體系，并初步應(yīng)用于HCC組織樣本的檢測(cè)中。DHPLC是一種高通量、自動(dòng)化的基因突變檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)已在醫(yī)學(xué)、癌癥、藥物等研究領(lǐng)域開(kāi)展應(yīng)用，與SSCP和DNA直接測(cè)序等突變檢測(cè)技術(shù)相比，DHPLC具有靈敏性更高，特異性更強(qiáng)，廉價(jià)省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。DHPLC用來(lái)檢測(cè)DNA突變和單核酸多態(tài)性，可以取代傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)，不需要制備凝膠，檢測(cè)DNA片段做到了全自動(dòng)、高效、快速、準(zhǔn)確，在疾病相關(guān)基因突變檢測(cè)方面提供了有效的技術(shù)手段，是一種快速有效的基因突變篩查方法。已有研究表明，ZHX2對(duì)多種HCC相關(guān)基因有調(diào)控作用，強(qiáng)烈提示其在HCC發(fā)生中的作用。盡管ZHX2調(diào)控的基因都具有HCC特異性表達(dá)特點(diǎn)，然而其自身表達(dá)廣泛，且在多種哺乳動(dòng)物中十分保守〔6〕。2006年Lv等報(bào)道，在HCC中發(fā)現(xiàn)了ZHX2啟動(dòng)子區(qū)的高度甲基化和甲基化介導(dǎo)的ZHX2基因表達(dá)缺失〔7〕。另有研究顯示ZHX2表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤惡性程度及病人預(yù)后呈負(fù)相關(guān)〔8〕。ZHX2的這種表達(dá)特點(diǎn)和在腫瘤中的甲基化修飾提示ZHX2具有抑癌基因特性，然而其在HCC發(fā)生中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用DHPLC發(fā)現(xiàn)在正常肝組織未檢測(cè)到ZHX2基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，而24例HCC癌組織中有11例(45.8%)存在甲基化，提示該甲基化是腫瘤相關(guān)性的。另外，有16.6%癌旁肝組織也能檢測(cè)到甲基化，但明顯低于癌組織，有可能是由于癌旁肝組織存在不同程度的肝硬化或慢性炎癥，而并非完全正常肝組織，但也說(shuō)明該甲基化有可能在HCC發(fā)生的早期或者癌前病變時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)。2006年呂自力等〔9〕使用甲基化特異的PCR方法，對(duì)6例正常肝組織和32例HCC癌組織及其癌旁肝組織中ZHX2基因啟動(dòng)子甲基化的情況進(jìn)行了檢測(cè)，所得甲基化的數(shù)據(jù)與本研究相似，其結(jié)論為HCC中ZHX2基因啟動(dòng)子甲基化與患者血清AFP值及是否伴隨轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與腫瘤直徑及分化程度無(wú)關(guān)，與本研究相同。同時(shí)，基于ZHX2基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率在有轉(zhuǎn)移組的HCC癌組織中高于無(wú)轉(zhuǎn)移組，呂自力等推測(cè)可能是ZHX2基因通過(guò)與NF-YA結(jié)合后影響MMPs及TIMPs等與HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)〔9～11〕，參與或調(diào)節(jié)HCC的轉(zhuǎn)移，提示ZHX2甲基化的檢測(cè)為判斷HCC預(yù)后提供參考。

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