VDR基因TaqI位點單核苷酸多態性與寧夏回漢人群中重度慢性牙周炎易感性的相關性

張 慶 彭明勇 馬 敏 (寧夏回族自治區第三人民醫院口腔科，寧夏 銀川 7500)

牙周炎是一種由多因素引起的感染性疾病，牙周細菌和機體防御機能的相互作用決定疾病的過程和進展〔1〕。維生素D受體(VDR)在維持機體鈣、磷代謝，調節細胞增殖、分化等方面起著重要的作用。關于VDR基因多態性的研究，目前發現與個體生長發育及人類疾病相關的基因多態性分別對應限制性內切酶TaqⅠ、BsmⅠ、ApaⅠ、FokⅠ的酶切位點。本研究采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法，探討VDR基因TaqⅠ位點單核苷酸多態性與寧夏回漢人群中重度CP的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集病例組178例患者2007年10月至2009年10月就診于寧夏醫科大學附屬醫院口腔科的患者和健康對照者187例(健康志愿者)。以上研究對象均為寧夏本地人群，并且均知情同意參加本實驗，簽署知情同意書。病例組納入標準:3代均為漢族或回族，未與其他民族通婚;口內至少有14顆牙存在其中包括4顆磨牙(不含第三磨牙);無明顯的錯牙合畸形及不良修復體等;無糖尿病、心血管病等系統性疾病;不吸煙或戒煙5年以上;全口至少3個象限內，每1象限內至少有兩顆牙齒的探診深度(PD) ＞4 mm、附著喪失(CAL)≥3 mm;X線顯示牙槽骨吸收≥根長的1/3。對照組納入標準:3代均為漢族或回族，未與其他民族通婚，牙周健康，全身健康無系統性疾病。由同一名醫師對所有受檢者進行全口牙周檢查，記錄口腔中所有余留牙的6個位點的牙周袋深度(probing depth，PD)及臨床附著喪失(clinic attachment loss，CAL)，參照ARMITAGE等〔2〕推薦標準:健康對照組:平均CAL≤0.5 mm，無鄰面位點CAL≥3 mm;缺失牙≤2顆(第三磨牙、正畸拔牙、外傷性失牙、大面積齲壞失牙及先天性缺失牙除外)。對病例組和對照組的年齡和性別分布進行χ2檢驗，各組一般資料比較均無統計學差異，見表1。

1.2 主要試劑 血液基因組 DNA提取試劑盒、2×Taq PCRMasterMix、DNA markerⅠ(北京 TIANGEN 公司)、引物由北京奧科生物技術有限公司合成(F:5'-GGAGAAGTCACTG-GAGGGC-3'，R:5'-GGATCATCTTGGCATAGAGC-3'〔3〕)、Taq Ⅰ限制性內切酶(MBI公司提供)、PCR儀、電泳儀、全自動凝膠圖像分析儀，電熱恒溫水浴箱、臺式離心機。

表1 各組年齡性別比較(n)

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 采取外周靜脈血5 ml，采集管中加入EDTA抗凝，4℃保存。采用上述DNA提取試劑盒提取外周血總基因組DNA，－20℃保存。

1.3.2 PCR 擴 增 模 板 DNA 2 μl，dNTP 2.5 μl(2.5 mmol/L)，10 × 緩沖液 2.5 μl(含 Mg2+)，引物 S、A 各1.0 μl(15 pmol/L)，TaqDNA 聚合酶 0.25 μl，用無菌去離子水補足總體積至25 μl。反應條件為:預變性94℃ 5 min;94℃30 s，62℃ 45 s，72℃ 45 s，35 個循環，最后 72℃延伸 5 min。擴增片段長度為307 bp。

1.3.3 TaqⅠ酶切 酶切總體系20 μl，其中PCR擴增產物8 μl，相應緩沖液 1.5 μl，TaqⅠ內切酶 1 U，加無菌去離子水補足總體積，于37℃水浴消化過夜。不含TaqⅠ(T^CGA)酶切位點，只出現307 bp一個片段;含有該酶切位點，被切成2個片段(209 bp、98 bp)。

1.3.4 多態性分析 取酶切產物10 μl，用2.5%的瓊脂糖凝膠(含溴乙啶)電泳，凝膠成像分析系統觀察結果并分析基因型。分型標準:CC基因型為307 bp 1個片段，CT基因型為307、209、98 bp 3 個片段，TT 基因型為209 bp、98 bp 2 個片段。

1.3.5 PCR質量控制措施 所有實驗標本的測定均在盲法下進行，并隨機抽取10%樣本作重復性實驗，檢測PCR結果的可靠性。隨機選擇10%的標本進行PCR擴增后直接測序，以驗證酶切所得的基因型數據結果的準確性。

1.4 統計學分析 (1)Hard-Weinberg Equilibrium分析(H-W平衡):本研究應用H-W平衡軟件計算基因型的分布，P＞0.05，則說明研究人群符合 H-W 平衡。(2)病例-對照分析(Case-Control Test):用SPSS13.0統計軟件處理數據，采用 χ2檢驗，對病例組和對照組的一般資料(年齡、性別)及兩組基因型和等位基因頻率的分布進行比較。

2 結果

樣品提取、PCR擴增和酶切均獲成功，基因型測定的典型電泳結果見圖1，測序圖見圖2。回、漢族兩組VDR基因TaqⅠ位點基因型和等位基因頻率的分布見組間有顯著差異(均P＜0.05)，但兩民族的CP組基因型和等位基因頻率分布無差異(χ2=0.074，P=0.785;χ2=0.072，P=0.788)，表2、表3。

圖1 VDR基因rs731236位點限制性片段長度多態性

圖2 VDR基因TaqⅠ(rs731236)位點測序結果

表2 回族TaqⅠ(rs731236)位點基因型及等位基因頻率的分布〔n(%)〕

表3 漢族TaqⅠ(rs731236)位點基因型及等位基因頻率的分布〔n(%)〕

3 討論

牙周炎是發生在牙周支持組織上的慢性感染性疾病，是造成老年人失牙的最主要的原因〔3〕。其發病率因國家、地區和種族的不同而有所差別〔4〕并且早期臨床表現不明顯，就診時牙周組織往往已經發生了不可逆的變化，進而嚴重影響牙合系統的完整性和咀嚼功能，同時牙周炎會成為病灶影響全身的健康及加重一些全身疾病的進展。隨著我國進入老齡化社會，牙周病將成為突出的健康問題。

Michalowicz等〔5〕采用遺傳學經典雙生子法揭示遺傳因素與牙周炎的發生、發展存在重要關系和近些年流行病學深入研究的雙重影響下，越來越多的證據表明不同宿主對牙周炎的易感性有很大差異，某些基因的遺傳多態性影響著牙周炎的發生、發展。文獻報道與牙周炎易感性有關的基因有:白細胞介素-1基因(IL-1)、VDR基因、腫瘤壞死因子α基因(TNF-α)、基質金屬蛋白酶(MMPs)等。牙周炎的主要癥狀之一就是牙槽骨的吸收，牙槽骨是全身骨骼系統的一部分，也是全身骨骼系統中變化最為顯著的部分，其變化與牙齒的發育、萌出及乳、恒牙的替換、咀嚼功能的發揮和牙齒的移動等有關系。該變化反映出骨組織的改建過程，即破骨和成骨兩者相互平衡的生理過程〔6〕。VDR基因直接與骨密度代謝有關，成為研究CP的一個熱點基因。

在我們的研究結果中:漢族和回族CP組及對照組均未出現TT基因型，這可能與TT基因型在中國漢族人群中的攜帶率低等因素有關，還可能與樣本量較少有關。我國漢族人群TT基因型頻率為0.6%，與韓國人的分布頻率相似〔7〕，而遠低于白種人的分布頻率(TT基因型頻率均為10% ～17%)〔6〕。關于TaqⅠ位點與CP的研究，國內外學者在不同地區對不同種族的人群進行了大量研究，結論有較大分歧。Nibali等〔8〕對英國79名CP和231名健康對照者進行了研究;de Brito等〔9〕、Borges等〔10〕在巴西人群中分別進行了研究;Tachi等〔11〕、Kobayashi等〔12〕在日本人群中分別進行了該位點的研究;國內王春先等〔13〕也進行了該點的研究，他們的研究結果提示TaqⅠ SNP位點可能與CP的易感性有關。本研究結果同以上學者的研究結果一致，但與 Gunes等〔14〕、Sun 等〔15〕、還有章錦才等〔16〕的研究結果不同。對于研究結果的不一致可能與不同地區、不同種族的遺傳特征不同有關，還可能與樣本量大小有關〔17〕。

關于TaqⅠ位點多態性的作用機制問題，有學者認為:在基因的翻譯、表達過程中，蛋白質的合成受mRNA 3'末端非翻譯區的調控，該區域的內在特性影響著mRNA的穩定性，它對RNA酶特別敏感，VDR基因TaqⅠ的酶切位點正位于該區域，如果該區域的堿基有任何改變，都會影響VDR基因的調控而影響VDR的表達，如改變受體的數量，影響增強子對靶位的親和力或影響與維生素D的親和力〔18〕。

慢性牙周炎是多因素引起的炎癥性疾病，微生物是其發生的始動因子，某些全身性疾病、遺傳、環境和行為因素等也可能是其發病的危險因素。VDR基因直接與骨代謝有關，不同地區、不同民族的遺傳學特征可能存在明顯差異。所以對于VDR基因多態性與CP之間的關系還需要在不同地區、不同民族之間進行更大樣本的研究，并進行以家系為基礎的關聯研究，還要與其他可能的易感基因進行連鎖分析。

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