塞來昔布對宮頸癌Hela細胞增殖及凋亡的影響及作用機制

董文輝 呂玉人 劉永茂 (民航總醫院婦產科，北京 00025)

環氧合酶(COX)是花生四烯酸代謝過程中前列腺素(PGS)合成的限速酶〔1〕，有 COX-1 和 COX-2 兩種同工酶〔2〕。近年研究發現宮頸癌細胞中COX-2表達。塞來昔布(celecoxib)是第一個高效的COX-2特異性抑制劑〔3〕，對腫瘤的發生、發展和轉移均有抑制作用。本研究旨在觀察塞來昔布對人宮頸癌Hela細胞株增殖和凋亡的影響，并進一步探討塞來昔布影響宮頸癌細胞增殖和凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及材料 人宮頸癌Hela細胞購自中科院上海細胞所，塞來昔布購自美國輝瑞公司(BK10CCEE069)，四甲基耦氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，RPMI-1640購自美國Hyclone公司。

1.2 儀器 37℃恒溫空氣搖床(上海醫療器械廠)，低溫高速離心機(德國寶麗曼公司)，80I熒光顯微鏡(日本尼康公司)，-80℃冰箱(日本三洋公司)，LD-5臺式離心機(北京六一儀器廠)，SM-510高壓滅菌鍋(美國YAMATO公司)，電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)，pH計(上海精密儀器公司)，磁力攪拌器(上海精密儀器公司)，SW-CJ-1 FD超凈工作臺(深圳市銘科化工有限公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，MCO-175型CO2孵箱(日本三洋公司)，BCD-2398TC冰箱(青島海爾股份有限公司)，75 cm2細胞培養瓶斜口、24孔板，Nunclon細胞培養板(丹麥Nunc公司)。

1.3 方法

1.3.1 塞來昔布配制 取膠囊1粒(含塞來昔布200 mg)，加入20 ml含少量DMSO的生理鹽水充分攪拌成混懸液，現用現配。0.22 μm濾膜除菌，再用 RPMI-1640培養液稀釋80倍(320 μmol/L)備用。

1.3.2 細胞培養 人宮頸癌Hela細胞接種于細胞培養瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液置于5%CO2的37℃培養箱中培養，待其貼壁生長至70% ～80%時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～3 d傳代1次。

1.3.3 Hela細胞塞來昔布體外誘導 將處于指數生長期的Hela細胞，用含10%新生牛血清的 IMDM制成5×104個細胞/L細胞懸液，每孔100 μl接種于96孔板孔內。培養24 h后，換成含3%新生牛血清的維持培養液100 μl/每孔。接種3塊板(24、48、72 h時間點各1塊)。實驗組分別加入100 μl終濃度為20、40、80、160 μmol/L 的塞來昔布，每濃度重復6 孔，同時設單細胞懸液不加藥物的正常對照及無細胞培養液的空白對照，于5%CO2的37℃培養箱中分別培養24、48、72 h。

1.3.4 細胞抑制率測定 在每個不同時間點，取對應的細胞培養板進行測定。首先于每孔中加入新鮮配制的MTT液20 μl，繼續培養4 h;然后吸去孔內上清液，每孔加入 DMSO 150 μl振蕩至結晶物充分溶解后，在全自動酶標儀上570 nm處檢測吸光度(A)值，計算細胞生長抑制率。

2 結果

隨藥物濃度的增加、作用時間的延長塞來昔布對Hela細胞的增殖抑制效應，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，并呈現時間和濃度的依賴性。

當濃度為80 μmol/L塞來昔布作用Hela細胞48 h后，對Hela細胞的增殖起到明顯的抑制作用，其OD值0.732±1.83，抑制率為30.76%;作用72 h后OD值為0.421±1.89，抑制率為61.90%。因此本文選擇80 μmol/L的塞來昔布作為實驗用量。

表1 塞來昔布對Hela細胞增殖抑制效應的影響(±s)

表1 塞來昔布對Hela細胞增殖抑制效應的影響(±s)

與對照組比較:1)P＜0.01

組別 24 h OD IR(%)48 h OD IR(%)72 h OD IR(%)20 μmol/L 1.125±1.031) 2.933±1.43 0.987±2.21 10.17±1.561) 0.813±2.14 26.43±1.331)1.159±1.89 1.113±2.151 1.105±2.53 40 μmol/L 0.933±1.171) 14.31±1.56 0.868±1.87 19.78±1.691) 0.638±2.23 42.26±2.051)80 μmol/L 0.831±1.881) 28.31±3.37 0.732±1.831) 30.76±2.53 0.421±1.891) 61.90±1.761)160 μmol/L 0.89±1.781) 40.55±2.45 0.565±2.131) 49.24±2.851) 0.355±1.581) 67.87±2.331)對照組

3 討論

文獻報道，在COX-2與宮頸癌的研究中，目前主要的相關結論有:①與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中COX-2表達陽性率增高，腺癌較鱗癌更高 (80.7%和40.6%)，精液可上調宮頸癌Hela細胞系COX-2的表達，并誘導PGE2受體表達。②宮頸腺癌中COX-2可促進腫瘤血管生成和腫瘤增殖，與腫瘤進展相關。③宮頸癌COX-2的表達與淋巴結轉移和宮旁轉移有相關性。④檢測COX-2在宮頸癌腫瘤組織/間質表達強度之比，可用于預測放化療的敏感性，比值越高，患者反應越差，3 年無病生存率越低〔4，5〕。

COX-2抑制劑發揮抗癌作用的機制有:①抑制腫瘤細胞生長的同時，對正常細胞的影響較少。②抑制腫瘤血管生成，降低腫瘤細胞轉移能力。COX-2抑制劑可抑制VEGF的合成，降低腫瘤微血管密度，以劑量和時間依賴關系抑制腫瘤的侵襲和轉移。③增強腫瘤細胞對放療和化療的反應性。Sorensen等的研究發現，低濃度的塞來昔布能明顯增強博來霉素、順鉑、長春新堿的細胞毒作用。④增強腫瘤免疫治療的效果。⑤可逆轉腫瘤引起的消瘦和高鈣血癥〔6～10〕。

本實驗結果提示塞來昔布促進細胞凋亡的作用可能大于抑制細胞增殖的作用，為塞來昔布應用于宮頸癌的輔助治療提供了實驗依據。

許多針對宮頸癌的細胞毒性化療藥物對人體正常組織有毒性作用，致使很多患者難以耐受，因而不能有效抑制宮頸癌的生長。而在本研究中，選擇性COX-2抑制劑能在體外有效抑制宮頸癌細胞的生長，選擇性越高，抑制作用越強塞來昔布不抑制人胃黏膜前列腺素的產生，消化性潰瘍的發生率較傳統非甾體抗炎藥降低50%。其對宮頸癌生長的高效抑制和低副反應，提示可能成為治療宮頸癌的有效藥物，其臨床療效尚有待進一步驗證。

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