老年性瘙癢癥小鼠模型的研制

李文露 黃妍麗 張文軍 周永紅 (暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，廣東 廣州 510632)

老年性皮膚瘙癢癥，中醫(yī)稱為“癢風(fēng)”或“風(fēng)瘙癢”，是困擾老年人的常見瘙癢性疾病，發(fā)病率約占40.7%。目前和瘙癢有關(guān)的分子學(xué)基礎(chǔ)和病理生理學(xué)機(jī)制尚未清楚，直接影響到臨床治療藥物的開發(fā)和研究〔1，2〕。本文擬以中醫(yī)傳統(tǒng)理論為指導(dǎo)，中醫(yī)整體觀為原則，結(jié)合風(fēng)瘙癢形成的內(nèi)因和外因，采用綜合因素造模的方法來進(jìn)行老年性瘙癢癥實(shí)驗動物模型的研制，為探討該病的發(fā)病機(jī)制和臨床療效評價提供一種可靠的實(shí)驗工具〔3〕。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗動物 普通級昆明種小鼠22只，7月齡，SPF級，雌雄不限，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心提供〔許可證號:SCXK(粵)2008-0020〕。

1.2 動物飼料、藥品及試劑 低鐵飼料，由廣州市花都區(qū)花東信華實(shí)驗動物養(yǎng)殖場配制(配方:玉米淀粉54%，奶粉40%，豆油5%，食鹽1%〔1〕)。變色硅膠，由青島森威化工有限公司生產(chǎn)，規(guī)格:HG/T2765.4-2005，500 g/瓶。Na2CO3固體，由北京化工廠生產(chǎn)，批號:900401，500 g/瓶。

1.3 儀器設(shè)備 OLYMPUS倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司，型號CKX41);冷凍切片機(jī)(北京中西泰安技術(shù)服務(wù)有限公司，型號M288815);蘇木素伊紅染色試劑盒(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，型號m179794)。

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 實(shí)驗前 取小鼠22只，稱量體重后隨機(jī)抽取4只小鼠，取尾靜脈血，測全血RBC、HGB、HCT、WBC、嗜酸性粒細(xì)胞;將2只小鼠脫頸椎致死，剪下腹部、前腿皮膚制成皮膚組織切片在顯微鏡下觀察其皮脂腺并記錄。剩余20只小鼠第1天實(shí)驗前采用錄像記錄10 min并記錄其搔抓次數(shù)，以小鼠前爪搔抓頭部，后爪搔抓軀干，嘴咬全身各部位作為瘙癢指征。

1.4.2 低鐵飼料〔4，5〕喂養(yǎng) 第1天記錄搔抓次數(shù)后，開始飼喂小鼠低鐵飼料，每天飼料量控制約8 g/只，飲水量每天約8 ml/只。從第3天開始隔天定時繼續(xù)對各組小鼠錄像，觀察和記錄10 min內(nèi)小鼠搔抓次數(shù)。

1.4.3 綜合刺激 在飼喂低鐵飼料的同時，從實(shí)驗第11天開始對小鼠進(jìn)行綜合的物理刺激。具體步驟為:①錄像記錄后將小鼠放入事先置入冰袋的人工氣候箱內(nèi)的鐵籠中，電吹風(fēng)吹冷風(fēng)檔對著冰塊吹風(fēng)30 min;②應(yīng)用60℃、pH=9的400 ml Na2CO3溶液從氣候箱兩側(cè)持續(xù)噴灑小鼠;③將小鼠置于鼠籠內(nèi)，籠內(nèi)事前鋪置細(xì)碎化纖布料，厚度約為0.5～1 cm;1個裝有36 g變色硅膠的鏤空小瓶。以上步驟隔天進(jìn)行一次。實(shí)驗開始第3周后對所有小鼠稱量體重，隨機(jī)抽取小鼠樣本進(jìn)行血液取樣和皮膚取樣，檢測方法同上。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，小鼠所有參數(shù)均以表示，組間差異采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 瘙癢次數(shù) 由圖1可見，第13天至第25天小鼠瘙癢次數(shù)恒定保持在較高水平，瘙癢程度較為明顯且穩(wěn)定。

圖1 小鼠瘙癢次數(shù)時間變化曲線

2.2 血樣結(jié)果 由表1可見，血液凝滯度增加，小鼠出現(xiàn)了一定程度的陰傷化燥癥狀。

表1 小鼠血液中相關(guān)指標(biāo)的變化()

表1 小鼠血液中相關(guān)指標(biāo)的變化()

血液檢測項目 第1天 第27天RBC(104/μl)855.0±157.19 1 034.0±306.29 HGB(g/L) 125.5±21.30 150.7±54.28 HCT(10－3) 416.0±70.43 490.0±150.70 EO#(10/μl)25.25±6.85 42.3±10.69

2.3 皮膚組織切片 對比實(shí)驗前后的皮膚組織切片，皮脂腺出現(xiàn)明顯聚集現(xiàn)象、皮脂腺腺泡細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)空泡顯著增加。見圖2。

圖2 實(shí)驗前后小鼠的皮脂腺(HE，×100)

3 討論

早在隋代《諸病源候論》中就曾提到“風(fēng)瘙癢者，是體虛受風(fēng)，風(fēng)入腠理，與血?dú)庀嗖阃鶃砼c皮膚之間。邪氣微，不能沖擊為痛，故但瘙癢也。”老年性瘙癢癥在中醫(yī)的病癥分型中多屬“血虛風(fēng)燥型”〔6，7〕，《圣濟(jì)總錄》“論曰風(fēng)瘙癢者，表虛衛(wèi)氣不足，風(fēng)邪乘之，血脈留滯。中外鼓作，變而生熱。熱則瘙癢，久不差，淫邪散溢，搔之成瘡。”本實(shí)驗獨(dú)創(chuàng)性提出以中醫(yī)傳統(tǒng)理論為指導(dǎo)，以中醫(yī)整體觀為原則，結(jié)合風(fēng)瘙癢形成的內(nèi)因和外因采用綜合因素造模，實(shí)驗注重環(huán)境因素對疾病的影響的同時，亦重視老年人的生理病理特點(diǎn)，尤其是模擬中醫(yī)臨床證候的發(fā)病特點(diǎn)，避免了以往建立瘙癢癥模型時的缺陷。值得一提的是，實(shí)驗中依據(jù)老年性瘙癢癥的常見病因選擇三個較具參考意義的物理因素(冷風(fēng)吹、熱堿性噴霧、化纖布料)刺激〔8，9〕并結(jié)合血虛風(fēng)燥內(nèi)因進(jìn)行綜合因素造模。

本實(shí)驗數(shù)據(jù)顯示小鼠的HCT值末次較前次出現(xiàn)升高，表明實(shí)驗中控制飲水及物理刺激具有一定成效，小鼠出現(xiàn)了一定程度的陰傷化燥癥狀。但實(shí)驗中RBC和HGB值出現(xiàn)了不同程度的增高，考慮可能與HCT升高，小鼠的血清容量相對下降，血液濃縮后造成RBC和HGB值出現(xiàn)了暫時性的升高〔10〕有關(guān)。

模擬血虛風(fēng)燥的外因造模時我們主要采用了觀察小鼠搔抓次數(shù)來評價瘙癢癥狀〔11〕和皮脂腺病理切片的方法。實(shí)驗之初動物搔抓次數(shù)明顯增加，物理刺激開始后搔抓次數(shù)出現(xiàn)較大幅度提升，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)值隨之升高〔10〕，表明實(shí)驗選取的外因刺激確能誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)瘙癢癥狀。但由于小鼠對物理刺激具有一定的耐受性，后期一度出現(xiàn)了小鼠搔抓次數(shù)的下跌，這也提示我們最佳的造模時間是第13～25天。在整個實(shí)驗過程中，通過病理切片可以看到小鼠的皮脂腺在實(shí)驗前后發(fā)生明顯改變，實(shí)驗后皮脂腺出現(xiàn)明顯聚集現(xiàn)象、皮脂腺腺泡細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)空泡顯著增加。綜上所述，多種指證均提示采用物理因素結(jié)合血虛風(fēng)燥內(nèi)因進(jìn)行綜合因素造模的方法具有一定的可行性。

由于本科生從事實(shí)驗研究的局限性，初步建立的老年性瘙癢癥實(shí)驗動物模型還需要進(jìn)一步完善:如應(yīng)積極尋找與人體發(fā)病特點(diǎn)更為相近的實(shí)驗動物，以及對于造模后的細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行更為深入的觀察等等。雖然最終適用于臨床藥物研究和療效評價的建模方法尚有待進(jìn)一步探索，但課題研究中積累的寶貴經(jīng)驗將使我們受益終身。

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3 肖 蕓，方肇勤.中醫(yī)證候動物模型的研究進(jìn)展〔J〕.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2008;10(55):64-5.

4 錢曉飛.特殊配方飼料引起實(shí)驗動物體重增長緩慢的原因探討〔J〕.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007;17(12):752-4.

5 苗明三，方曉艷，孫艷紅.血虛動物模型復(fù)制的思考〔J〕.光明中醫(yī)，2003;18(103):8-9.

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7 李建生，劉讀文.中醫(yī)老年醫(yī)學(xué):基礎(chǔ)與實(shí)踐〔M〕.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2005:38.

8 王樹椿.老年皮膚病學(xué)〔M〕.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1991:172.

9 王慶坦，羅 莉.老年人皮膚瘙癢的臨床分析〔J〕.醫(yī)學(xué)信息，2009;(22)6:1028.

10 王鴻利.實(shí)驗診斷學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:67-77.

11 沈非沉，王 暉，薛漫清.瘙癢動物模型的研究進(jìn)展〔J〕.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007;17(3):182-5.