大鼠側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素導(dǎo)致腦內(nèi)能量減少及tau蛋白磷酸化增多

褚文政 王曉彤 佴 玉 于國平 錢采韻

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺毓磺頂醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 煙臺 264000)

散發(fā)性阿爾茨海默病(Sporadic Alzheimer's disease，SAD)的病因及發(fā)病機制至今不清，通常認(rèn)為與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。早期的腦葡萄糖代謝異常與癡呆癥狀明顯相關(guān)。神經(jīng)元的糖代謝異常歸因于胰島素/胰島素受體(insulin/insulin receptor，I/IR)信號系統(tǒng)功能紊亂，ATP減少和I/IR功能紊亂均與β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積和tau蛋白過度磷酸化密切相關(guān)。已發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)側(cè)腦室注射(intracerebroventricular injection，icv)可導(dǎo)致腦內(nèi)胰島素受體磷酸化能力及內(nèi)在酪氨酸激酶活性下降，從而引起I/IR轉(zhuǎn)導(dǎo)功能紊亂，進(jìn)一步引起腦內(nèi)葡萄糖代謝功能障礙及其他與SAD類似的病理變化。本研究試圖驗證側(cè)腦室注射STZ后是否可導(dǎo)致腦內(nèi)能量減少及tau蛋白磷酸化增多等與SAD相似的病理變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和分組 成年雄性SD大鼠44只，體重250～320 g，由廣東省實驗動物中心提供，按隨機數(shù)字表法分為STZ組和生理鹽水(NS)組，每組22只。每只動物術(shù)前、術(shù)后第10、21天分別用快速血糖儀測尾靜脈血糖，術(shù)前，術(shù)后無差別。

1.1.2 主要試劑 STZ(美國Introvengen公司);ATP酶檢測試劑盒(南京建成公司)。5'-ATP鈉鹽(美國 Sigma公司)。tau-PSer202，tau-PSer396(美國 Biosource 公司)，tau-PSer404(美國Santa Cruz公司)。Western印跡試劑盒(美國 Roche公司)。SABC顯色試劑盒(福建邁新公司)。

1.1.3 主要儀器 大鼠腦立體定向儀(SN3日本);微量注射儀，微量血糖儀(美國強生公司);液相色譜儀(美國Water公司)。電泳儀及圖像采集分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。紫外分光光度儀:UV-120-02型(日本津島公司);JVC ky-F30B 3-CCD彩色圖像攝錄輸入儀(日本)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后，固定于SN3型腦立體定向儀。常規(guī)消毒皮膚，正中矢狀切口，分離骨膜，錐顱器鉆開顱骨，暴露硬腦膜。微量注射器每側(cè)側(cè)腦室注射STZ 10 μl(約3 mg/kg，注射前將STZ溶于生理鹽水，濃度10%)。坐標(biāo)參照文獻(xiàn)〔1〕:前囟后1.5 mm，矢狀縫左右旁開1.5 mm，腦表面下3.5 mm。第3天重復(fù)注射，劑量同前。對照組以等量NS代替STZ，其余操作相同。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)21 d。

1.2.2 高效液相法檢測大鼠腦海馬區(qū)ATP含量 分別取STZ組和NS組大鼠各8只，麻醉取腦，冰上分離海馬，每50 mg加入0.5 ml高氯酸，冰上勻漿，取上清，4℃離心10 000 r/min，5 min，再取上清，0.5 mol/ml氫氧化鈉調(diào)pH至7.6～7.8;低溫離心5 min，上清液氮保存，分析前取出解凍，20 μl上樣。色譜條件:色譜柱:hypersil液相色譜柱(BDSC)18不銹鋼柱(5 μm，ID4.6×30 cm);流動相:150 mmol/L磷酸二氫鉀(pH6.45)，流速0.8 ml/min;紫外檢測波長為254 nm;色譜行為:保留時間約17 min;標(biāo)準(zhǔn)曲線:ATP 2.2 ～ 55 μg/ml，Y=29 246.2X-18 246.2，r=0.999 7。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測海馬 tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404陽性細(xì)胞表達(dá) 建模后21 d，分別取STZ組和NS組大鼠各8只，常規(guī)麻醉，灌注，取腦，連續(xù)冰凍切片，片厚5 μm。行SABC免疫組織化學(xué)檢查，一抗為兔抗大鼠1∶100 tau-PS-er202、1∶200 tau-PSer396、1∶100 tau-PSer404。陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，陽性細(xì)胞呈棕黃色。

1.2.4 Western印 跡 檢 測 海 馬 tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404表達(dá) 取STZ組大鼠和NS組大鼠各6只，麻醉，斷頭取腦，冰上分離海馬，估計體積，加入2倍體積的預(yù)冷細(xì)胞裂解液，4℃離心，測蛋白濃度(Bradford法檢測)，將上清液蛋白濃度調(diào)整為2.5 μg/μl。樣品變性后，于8%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上樣，每孔上樣 20 μl及 Marker 8 μl，4℃過夜。將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉后，加入兔抗大鼠 tau-PSer202(1∶6 000)、tau-PSer396(1∶4 000)和 tau-PSer404(1∶800)抗體，4℃過夜。以 β-actin(1∶3 000)作內(nèi)參照。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG1∶2 000，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素1∶1 000，室溫輕搖40 min。用增強化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色。暗室中用X感光膠片曝光10 s～5 min，顯影1 min，定影3 min。根據(jù)發(fā)光的速度和強度，適當(dāng)調(diào)整曝光時間，晾干后觀片、拍照。應(yīng)用AlphaImager 2200計算機全自動圖像分析軟件測量曝光后 X膠片上 tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404顯色條帶的面積(AREA)和平均光密度值(AVG)，獲得光密度值積分(IDV=AREA×AVG)，分別取 tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404的IDV值與內(nèi)參照β-actin的IDV值比較，即得到其蛋白表達(dá)的相對百分含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以表示，組間差異比較應(yīng)用t檢驗及方差分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組ATP含量的比較 STZ組和NS組海馬區(qū)ATP含量比較有顯著性差異〔(4.33±1.70)vs(8.62±3.11)，P＜0.05〕。

2.2 海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404陽性細(xì)胞表達(dá)STZ組和NS組分別取相同部位切片，計數(shù)每張切片海馬區(qū)相近部位隨機5個視野(10×20)下陽性細(xì)胞平均數(shù)。STZ組大鼠海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404陽性細(xì)胞數(shù)較NS組明顯增多，著色位于胞體與突起交接處及軸突處明顯，細(xì)胞形態(tài)沒有顯著變化。NS組大鼠腦內(nèi)很少 tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404陽性細(xì)胞。經(jīng)Alpha imager 2200圖像分析軟件計數(shù)，差別有顯著意義(P＜0.05)。提示側(cè)腦室注射STZ后可引起tau蛋白在這3個Ser位點上的的磷酸化增多。見表1，圖1。

2.3 海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404蛋白含量檢測

STZ組tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404在海馬部位表達(dá)明顯增多，NS組也有少量表達(dá)，兩者相對含量比較有顯著差別(P＜0.05)。多克隆抗體且tau蛋白存在異構(gòu)體，在SDS凝膠上可表現(xiàn)2條或2條以上相近條帶，分子量約55～65 kD。見表2，圖2。

表1 兩組大鼠海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404陽性細(xì)胞表達(dá)(，n=8)

表1 兩組大鼠海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404陽性細(xì)胞表達(dá)(，n=8)

與NS組比較:1)P＜0.05;下表同

組別 tau-PSer202 tau-PSer396 tau-PSer404 STZ組 152.53±72.1 261.6±52.61) 155.14±118.11)4.95±2.67 4.05±1.85 5.55±3.28 NS組

圖1 STZ和NS組大鼠海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396、tau-PSer404陽性細(xì)胞表達(dá)(DAB染色，×400)

表2 兩組大鼠海馬部位tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404相對含量(，n=6)

表2 兩組大鼠海馬部位tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404相對含量(，n=6)

組別 tau-PSer202 tau-PSer396 tau-PSer 404 STZ組 21.9±6.931) 30.62±3.831) 45.50±8.6121)NS組0.722±0.39 8.18±3.27 17.9±7.85

圖2 兩組大鼠海馬部位tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404蛋白Western印跡表達(dá)結(jié)果

3 討論

阿爾茨海默病(AD)患者腦葡萄糖代謝和細(xì)胞能量產(chǎn)生明顯受損〔3〕。在SAD初期，葡萄糖代謝紊亂引起 ATP減少約50%，并隨病程進(jìn)展而加重;而ATP對于維持大部分細(xì)胞和分子水平功能至關(guān)重要〔4〕，ATP減少可使細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運異常，膜對離子通透性改變，甚至造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，神經(jīng)細(xì)胞變性或興奮性傳遞受影響，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡及壞死〔5～7〕。伴隨ATP的減少，細(xì)胞線粒體受損嚴(yán)重，線粒體氧化磷酸化功能下降〔5，8〕。

在胎腦中tau蛋白約有6～8個磷酸化位點，在成人腦中約有2～3個磷酸化位點，其磷酸化水平可受發(fā)育調(diào)節(jié)。某些病理情況下tau蛋白可以異常磷酸化〔9〕。過度磷酸化的tau蛋白促進(jìn)微管蛋白聚集和組裝能力降低，導(dǎo)致微管穩(wěn)定性下降，影響胞體和軸突間的細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運，進(jìn)一步影響細(xì)胞功能或?qū)е录?xì)胞死亡。tau蛋白在色氨酸和蘇氨酸位點上的磷酸化受幾種蛋白激酶和蛋白磷酸脂酶調(diào)控。促使tau蛋白磷酸化的激酶中包括ATP-dependent胰激肽原酶(PK)erk36和PKerk40、糖原合成激酶(GSK)-3β 和3α，都是受 I/IR 系統(tǒng)控制的〔10〕。ATP減少也可以激活PKerk36和PKerk40〔11〕;I/IR系統(tǒng)缺陷可以激活 GSK-3β活性，均可引起 tau 的磷酸化〔9，10，12，13〕。tau 蛋白可有多種異構(gòu)體，通過不同的mRNA剪接而產(chǎn)生，模擬分子量約55～62 kD。

本文STZ組大鼠21 d后經(jīng)免疫組化檢測海馬區(qū)tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404陽性表達(dá)均比NS組明顯，染色位于胞質(zhì)及胞體與突觸結(jié)合處和軸突明顯。經(jīng)Western印跡檢測兩組海馬tau-PSer202、tau-PSer396和tau-PSer404含量也有顯著性差異。提示了STZ側(cè)腦室注射后可能通過干擾I/IR系統(tǒng)，導(dǎo)致一些控制tau蛋白磷酸化和去磷酸化的酶活性變化，以及ATP的減少都可以促進(jìn)tau的異常磷酸化。Hong等〔10〕在細(xì)胞水平已經(jīng)證實I/IR系統(tǒng)可以通過磷脂酰肌醇3-激酶(PIK-3)途徑抑制GSK-3β而調(diào)控tau蛋白的磷酸化水平。本文從大體模型證實用STZ干擾I/IR系統(tǒng)也可以導(dǎo)致tau蛋白的異常磷酸化，進(jìn)一步提示I/IR系統(tǒng)功能紊亂在SAD發(fā)病中可能發(fā)揮了一定作用。

1 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定向圖譜〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:30-5.

2 Clark JB，Nicklas WJ.The metabolism of rat brain mitochondria.Preparation and characterization〔J〕.J Biol Chem，1970;245(18):4724-31.

3 Hoyer S.Oxidative metabolism deficiencies in brains of patients with Alzheimers disease〔J〕.Acta Neurol Scand Suppl，1996;165:18-24.

4 Hoyer S.Glucose metabolism and insulin receptor signal transduction in Alzheimer disease〔J〕.Eur J Pharmacol，2004;490(1-3):115-25.

5 Kaur G，Bhardwaj SK.The impact of diabetes on CNS.Role of bioenergetic defects〔J〕.Mol Chem Neuropathol，1998;35(1-3):119-31.

6 Stokes DL，Delavoie F，Rice WJ，et al.Structural studies of a stabilized phosphoenzyme intermediate of Ca2+-ATPase〔J〕.J Biol Chem，2005;280(18):18063-72.

7 Torlinska T，Grochowalska A.Age-related changes of NA(+)，K(+)-ATPase，Ca(+2)-ATPase and Mg(+2)-ATPase activities in rat brain synaptosomes〔J〕.J Physiol Pharmacol，2004;55(2):457-65.

8 Labak M，F(xiàn)oniok T，Kirk D，et al.Metabolic changes in rat brain following intracerebroventricular injections of streptozotocin:a model of sporadic Alzheimer's disease〔J〕.Acta Neurochir Suppl，2007;106(1):177-81.

9 Plaschke K，Kopitz J，Siegelin M，et al.Insulin-resistant brain state after intracerebroventricular streptozotocin injection exacerbates Alzheimer-like changes in Tg2576 AbetaPP-overexpressing mice〔J〕.J Alzheimers Dis，2010;19(2):691-704.

10 Hong M，Lee VM.Insulin and insulin-like growth factor-1 regulate tau phosphorylation in cultured human neurons〔J〕.J Biol Chem，1997;272(31):19547-53.

11 Giasson BI，Cromlish JA，Athlan ES，et al.Activation of cyclic AMP-dependent protein kinase in okadaic acid-treated neurons potentiates neurofilament fragmentation and stimulates phosphorylation of Ser2 in the low-molecular-mass neurofilament subunit〔J〕.J Neurochem，1996;66(3):1207-13.

12 Ke YD，Delerue F，Gladbach A，et al.Experimental diabetes mellitus exacerbates tau pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease〔J〕.PLoS One，2009;4(11):7917.

13 Mandelkow EM，Drewes G，Biernat J，et al.Glycogen synthase kinase-3 and the Alzheimer-like state of microtubule-associated protein tau〔J〕.FEBS Lett，1992;314(3):315-21.