低氧對順鉑損傷A549細胞的影響

孔曉霞 李夢楠 朱雯婷 李 超 秦 臻 張 婷

(溫州醫學院低氧醫學研究所 機能實驗教學中心，浙江 溫州 325035)

低氧(Hypoxia)是許多惡性疾病的重要病理生理特征之一，大約有90%的實質性腫瘤中都存在低氧現象。適度的低氧環境可激發機體一系列內在的適應性過程，不但可以維持細胞的正常功能，而且對抵抗機體損傷具有一定作用〔1〕。自噬(Autophagy)是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程〔2〕。在低氧或者營養缺乏時，細胞能夠通過自噬方式獲取ATP以及其他保證基本代謝過程的營養物質，從而拮抗損傷，對細胞生存具有保護作用〔3〕。但是，過度激活的自噬會引起程序性細胞死亡，導致細胞生存率下降，這種細胞死亡方式被定義為自噬型細胞死亡〔4〕。可見，自噬在細胞分化和增殖中的作用依然存在著廣泛的爭議。本研究通過探討低氧條件對順鉑(DDP)抗腫瘤效應的影響及細胞自噬的作用，以進一步闡明低氧和腫瘤發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人非小細胞肺癌A549細胞株由溫州醫學院機能實驗中心保存。

1.1.2 儀器與試劑 激光共聚焦顯微鏡(FV1000型，日本O-lympus)觀察A549細胞熒光染色結果;酶標儀(美國Thermo公司)用于亞甲基四唑藍(MTT)法檢測細胞生存率。細胞培養用1640培養液以及新生牛血清購于美國Hyclone公司。DDP及免疫熒光染料(MDC)、熒光染料(Hoechst33342)均購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 A549細胞培養 A549細胞置于完全培養基(10%新生牛血清，1640培養液，pH7.4)中，37℃、5%CO2培養箱中培養。每2～3 d用0.25%胰酶消化后，換液傳代培養用于后續實驗。

1.2.2 MTT法測定細胞生存率 取對數生長期A549細胞，經消化制成細胞懸液，以每孔100 μl，1×104細胞數接種于96孔板，24 h后按實驗分組加入 10 μmol/L DDP和 20 μmol/L DDP，分別放入常氧(20%O2)和低氧培養箱(1%O2)。在8 h后加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續培養4 h后吸出培養液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩 10 min，570 nm 測其吸光度值。實驗重復3次。

1.2.3 MDC染色檢測細胞自噬空泡變化 MDC是一種自噬空泡的標志物，可以通過MDC染色觀察判斷細胞自噬過程的發生。以4%預冷的多聚甲醛，4℃下固定15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，加入終濃度為50 μmol/L的 MDC染色液，37℃孵育60 min，PBS洗2遍。激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞自噬空泡的變化。

1.2.4 Hoechst33342染色檢測細胞凋亡 取對數生長期A549細胞，經消化制成細胞懸液，以每孔5×104細胞數接種于24孔板中，細胞貼壁后，按照實驗分組在藥物處理后12 h，PBS洗2遍，棄上清，加入終濃度1 μg/ml的 Hoechst33342染色，37℃孵育15 min，PBS洗2遍，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色質凝集及形態變化。

1.3 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件，數據以表示，多組間比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結果

2.1 常氧和低氧條件下DDP對A549細胞增殖率的影響 在常氧條件下，單獨應用DDP作用于A549細胞12 h，細胞增殖率明顯下降，并呈劑量依賴性;而在低氧條件下，DDP對A549細胞的損傷作用明顯降低，細胞死亡率與常氧條件下的DDP組相比明顯降低(P﹤0.05)。見圖1。

圖1 常氧和低氧條件下DDP對A549細胞增殖率的影響

2.2 MDC染色檢測細胞自噬空泡變化 單獨應用10 μmol/L DDP作用于A549細胞時，未見MDC熒光聚集現象，表明細胞內無明顯自噬空泡堆積。單獨的低氧條件下或低氧條件下應用DDP作用A549細胞12 h，細胞均出現大量自噬空泡積聚，表明有自噬過程發生，并有明顯差異(P＜0.05)。見圖2。

2.3 Hoechst33342染色檢測細胞凋亡 單獨應用DDP作用A549細胞12 h，細胞核碎裂，染色質凝聚明顯，表明有顯著細胞凋亡過程發生;在單純低氧條件下，未見細胞核形態明顯變化，無明顯細胞凋亡發生。而低氧條件下，DDP作用A549細胞12 h，細胞染色質凝聚水平與常氧條件下DDP組相比顯著下降(P﹤0.05)，細胞損傷程度明顯降低。見圖3。

圖2 MDC染色檢測常氧或低氧條件下DDP作用A549細胞自噬空泡的變化及平均熒光強度分析(×600)

圖3 Hoechst33342染色檢測常氧和低氧條件下DDP對A549凋亡細胞核染色質濃縮的影響及平均熒光強度(×400)

3 討論

肺癌是目前全球癌癥發病率和死亡率位居第一的惡性腫瘤，探討其發生機制及有效的治療手段一直是受到廣泛關注的研究熱點之一。在正常機體中，氧濃度的變化對組織細胞的代謝、增殖、分化具有重要的調節作用。為了適應低氧條件，腫瘤細胞通過激活一系列信號機制，例如血管生成、細胞新陳代謝增強、遷移等，促進了細胞增殖、轉移、耐藥等。不僅改變了腫瘤細胞的生物學特性，引起腫瘤細胞的遺傳不穩定性及惡性選擇，導致腫瘤發生惡性轉化甚至轉移。而且研究表明低氧也是腫瘤細胞對放療、化療產生抗性的主要原因之一〔5〕。因此，低氧作為抗腫瘤靶點的研究備受許多學者關注。已有研究表明自噬在饑餓、氧化應激、低氧等條件下對細胞具有一定程度的保護作用〔6〕。本研究提示腫瘤細胞的低氧環境可能通過某種機制降低了DDP的損傷作用。

低氧誘導因子1(HIF-1)是低氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內的一種核轉錄因子，HIF-1α能夠上調BNIP3(只具有BH3區的Bcl2家族成員)的表達引起自噬蛋白Beclin 1活性增強，誘導自噬的發生，達到保護細胞的作用〔7，8〕。本實驗結果表明DDP作用A549細胞后，自噬水平變化不明顯，但低氧條件則能夠引起細胞發生自噬。常氧條件下應用DDP作用A549細胞，細胞核發生明顯皺縮，染色質凝聚。但低氧條件下，DDP對細胞核的損傷作用則顯著降低。這提示在低氧條件下，細胞自噬信號的激活，對于DDP誘導的細胞損傷可能起到了一種促增殖性的保護作用，進而降低了細胞死亡率。

以上結果表明，DDP能夠引起A549細胞發生凋亡，在低氧條件下引起的自噬降低了DDP的損傷作用，其具體機制及涉及的信號通路還有待于進一步探討。

1 Matsumoto S，Yasui H，Mitchell JB，et al.Imaging cycling tumor hypoxia〔J〕.Cancer Res，2010;70(24):10019-23.

2 Sato K，Tsuchihara K，Fujii S，et al.Autophagy is activated in colorectal cancer cells and contributes to the tolerance to nutrient deprivation〔J〕.Cancer Res，2007;67(20):9677-84.

3 Mizushima N，Levine B，Cuervo AM，et al.Autophagy fights disease through cellular self-digestion〔J〕.Nature，2008;451(7182):1069-75.

4 Abedin MJ，Wang D，McDonnell MA，et al.Autophagy delays apoptotic death in breast cancer cells following DNA damage〔J〕.Cell Death Differ，2007;14(3):500-10.

5 Degenhardt K，Mathew R，Beaudoin B，et al.Autophagy promotes tumor cell survival and restricts necrosis，inflammation，and tumorigenesis〔J〕.Cancer Cell，2006;10(1):51-64.

6 Cosse JP，Michiels C.Tumour hypoxia affects the responsiveness of cancer cells to chemotherapy and promotes cancer progression〔J〕.Anticancer Agents Med Chem，2008;8(7):790-7.

7 Azad MB，Chen Y，Henson ES，et al.Hypoxia induces autophagic cell death in apoptosis-competent cells through a mechanism involving BNIP3〔J〕.Autophagy，2008;4(2):195-204.

8 Zhang H，Bosch-Marce M，Shimoda LA，et al.Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to hypoxia〔J〕.J Biol Chem，2008;283(16):10892-903.