人參皂苷-Rg3對兔耳增生性瘢痕中Bcl-2、Bax表達的影響

劉鶴松 張可佳 吳 杰 趙自然 (吉林大學第一醫院皮膚性病科，吉林 長春 300)

細胞凋亡在病理性瘢痕(PS)形成中起著重要的作用。人參皂苷-Rg3(GS-Rg3)是從人參中分離提純的一種單體，為四環三萜類人參二醇型皂苷〔1〕。大量研究表明GS-Rg3能促進腫瘤細胞凋亡，并抑制其轉移。Bc1-2是一種凋亡抑制基因，其編碼蛋白能抑制細胞發生凋亡，并能在生長因子缺乏時延長細胞存活時間，甚至使細胞“永生化”〔2〕。Bax是在人前白細胞基因文庫中發現的一種凋亡相關基因，基本生物學特性是促進細胞凋亡，這一作用受Bcl-2的調節〔3〕。本實驗擬研究人參皂苷-Rg3對兔耳增生性瘢痕中Bcl-2、Bax蛋白質的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 大耳白兔24只，雌雄不拘，體重(2.5±0.2)kg，吉林大學實驗動物中心提供。根據時間分為2 w、4 w、6 w 及對照組。

1.2 主要儀器及試劑 主要儀器:高精度輪轉式石蠟切片機購自日本的LAICA。電熱恒溫干燥箱購自中國上海實驗儀器總廠。石蠟包埋機、恒溫孵化箱購自日本的SANYO。顯微鏡購自日本的OLYMPUS。CO2孵箱購自美國SHEL LAB;酶標儀購自美國BIO-RAD。免疫組化試劑盒、DAB顯示試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。主要試劑:GS-Rg3來自吉林大學基礎醫學院。檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 6.0)、0.01 mol/L(pH7.4)的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)為吉林大學白求恩醫學院配制。

1.3 動物模型的制備 用速眠新注射液0.2～0.3 ml/kg，肌肉注射。麻醉生效后，強力消毒碘消毒兔耳腹面皮膚，切除2 cm×2 cm的全層皮膚，每耳4～6處，創可貼包扎創面。將動物編號，分籠飼養。3 w后創面形成凸起的增生性瘢痕組織。于四組動物耳部增生性瘢痕組織處行局部封閉注射，實驗組注射GS-Rg3(濃度6 mg/2 ml)，對照組注射等體積的0.9%生理鹽水，每3 d一次。分別于用藥后2 w、4 w、6 w切取瘢痕組織，經4%多聚甲醛固定48～72 h，石蠟包埋切片。

1.4 實驗方法 所取瘢痕組織立刻經4%多聚甲醛-0.01 mol/L PBS(pH7.4)固定。6 h后，PBS漂洗4～5 h，每小時交換洗液，或4℃冰箱過夜。經乙醇常規脫水，二甲苯透明后。浸蠟、包埋。用石蠟切片機連續切片，每片標本4 μm厚，HE染色、免疫組化法中的鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP法)染色。PBS陰性對照。

1.5 結果判定 免疫組化染色陽性結果為棕黃色或棕黑色顆粒。每例切片隨機選擇5個高倍視野，計數每個視野中100個細胞中的陽性細胞數，計算5個視野的平均陽性率。

2 結果

2.1 兔耳增生性瘢痕大體觀察 兔耳腹側創面1 w左右上皮化，局部逐漸突起，圓形、淡紅色、質硬。上皮化后3 w左右，增生厚度為兔耳腹側皮膚全層厚度的3～4倍。隨著給藥時間的延長，60 d左右瘢痕開始逐漸軟化，體積縮小，逐漸趨于平復。而對照組繼續處于增生狀態。

2.2 GS-Rg3對兔耳增生性瘢痕中Bcl-2、Bax表達的影響GS-Rg3可明顯降低Bcl-2的表達水平，用藥后2 w開始表達量逐漸下降，6 w明顯減少;而對照組有較多量的Bcl-2表達。GSRg3可明顯增加Bax的表達，用藥后2 w開始表達量明顯增加，而對照組則有少量表達。見圖1、表1。Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Ced-9 等。這些家族的成員可形成同源或異源二聚體，調節細胞的死亡和存活。Bax是在人前白細胞基因文庫中發現的一種凋亡相關基因，定位表達于胞質內，在部分組織中與Bcl-2同時表達，并且Bax也不是總表達于細胞凋亡率高的組織。Bax的基本生物學特性是促進細胞凋亡，這一作用受 Bcl-2、Bcl-xl、Bad 調節。

表1 增生性瘢痕用藥前后Bcl-2、Bax表達比較(%，，n=24)

表1 增生性瘢痕用藥前后Bcl-2、Bax表達比較(%，，n=24)

與用藥前比較:1)P＜0.01

56.92±10.56 8.37±1.29用藥后2 w 27.98±7.311) 12.01±1.711)用藥后4 w 20.25±5.761) 16.89±2.331)用藥后6 w 14.89±3.111) 24.32±3.741)Bcl-2 Bax用藥前時間

圖1 增生性瘢痕Bcl-2、Bax陽性表達(免疫組化SP法，×40)

本實驗采用免疫組化技術，分別對兔耳增生性瘢痕中用藥前后Bcl-2蛋白質的表達進行了研究。結果顯示:GS-Rg3組Bcl-2蛋白質在用藥后2 w開始表達量逐漸下降，6 w明顯減少;而對照組有較多量的Bcl-2表達。為了評價Bax在增生性瘢痕中的作用，本文利用免疫組化方法檢測了Bax蛋白質，結果顯示:用藥后2 w開始表達量明顯增加，而對照組則有少量表達，表明GS-Rg3可導致Bax蛋白質表達增加，這也進一步證實了Bcl-2蛋白質表達降低和Bax蛋白質表達增加是導致成纖維細胞凋亡的關鍵。這與以往的研究結果一致，說明Bcl-2家族在增生性瘢痕形成和消退過程中起到非常關鍵的作用。

Bcl-2基因及蛋白質的表達可阻止細胞的凋亡，而Bax基因表達則有促進和誘導細胞凋亡的作用，Bcl-2與Bax可自身形成二聚體，也可相互作用成為二聚體。Bcl-2/Bax的比率高低也決定細胞處于凋亡或存活。在Bax缺少的情況下，Bcl-2的過量表達能阻止細胞凋亡。因此Bax和Bcl-2之間既存在競爭又能獨立地調控細胞凋亡〔7〕。Bax能在較為廣泛的pH范圍內形成離子通道，允許一些離子和小分子如細胞色素C等穿過細胞膜進入細胞質，從而引起細胞凋亡〔8〕。Bcl-2基因表達異常增加可使已有基因異常改變的成纖維細胞逃避凋亡，由此引起的基因異常事件的積累是導致瘢痕形成的必要前提。增生性瘢痕是組織損傷后修復過度的一種改變，表現為成纖維細胞的大量增生以及膠原等間質蛋白的沉積。Ladin等〔9〕發現，瘢痕疙瘩和培養的瘢痕疙瘩成纖維細胞中Bcl-2蛋白表達升高，并伴有細胞凋亡率降低。Bcl-2調控機制至今尚不明了，但有幾種理論已被廣泛承認:①Bcl-2蛋白作為一種抗氧化劑，控制線粒體膜的膜電位從而調節細胞的凋亡。②Bcl-2與Bax結合形成雜合二聚體，抑制Bax的促凋亡作用。③Bcl-2降低線粒體膜對一些凋亡蛋白前體的通透性，從而使細胞免于凋亡。④Bcl-2影響細胞內Ca2+重新分布，而Ca2+激活核酸內切酶。⑤通過蛋白激活放大，使得細胞骨架及其他小分子化合物發生改變。本文認為通過與Bax結合成雜合二聚體，可抑制Bax的促凋亡作用。是否同時存在其他調控機制有待深入研究。

3 討論

瘢痕增生一直是創傷修復領域的研究熱點。目前實驗研究主要從成纖維細胞的大量增殖與凋亡抑制，膠原的合成與降解失衡，大量細胞因子的產生以及三者的相互關系方面探求產生瘢痕的形成機制。大量研究表明人參皂苷Rg3作為中藥抗腫瘤藥物具有促進腫瘤細胞的凋亡、抑制腫瘤生長、抗腫瘤細胞黏附、侵襲和轉移、抑制腫瘤新生血管形成等作用〔4〕。

Bcl-2家族是一類基因結構相似、參與細胞凋亡調節的基因，在各種損傷及瘢痕形成過程中起非常重要的作用〔5，6〕。Bcl-2家族成員分為兩類，一類是能促進細胞凋亡的基因，成員有 Bax、Bad、Bid、Bik、Mcl-l和 Al;另一類能抑制細胞凋亡，包括

1 王本祥.人參研究進展〔M〕.天津科學技術出版社，1991:97-9，125-53.

2 Wong W，Gruber J.Viral interactions with the p53 gene in human cancer，NCI workshop〔J〕.J Natl cancer Inst，1994;86:177.

3 Oltvai ZN，Milliman CL，Korsmeyer SJ.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homology，Bax，that accelerates programmed cell death〔J〕.Cell，1993;74:609-19.

4 梁 宇，崔 凝，袁忠海.人參皂苷Rg3抗腫瘤作用的研究進展〔J〕.中國現代藥物應用，2007;1(11):105.

5 King ED，Matteson J，Jacobs SC，et al.Incidence of apoptosis，cell pro-liferation and Bel-2 expression in transitional cell carcinoma of the bladder association with tumor progression〔J〕.J Urol，2000;201:315-8.

6 Krajewski S，Krajewska M，Shabaik A，et al.Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax，a dominant inhibitor of Bcl-2〔J〕.Am J Pathol，2000;211:215-8.

7 紅 斌，翟琦巍，鄭仲承.Bcl-2基因的轉錄調控〔J〕.生物化學與生物物理學報，2000;32(2):95-9.

8 袁海波，沈忠明.細胞凋亡的分子機理〔J〕.上海大學學報，2001;7(1):77-80.

9 Ladin DA，Hou Z，Patel D，et al.The use of athymic nude mice for the study of human keloids〔J〕.Wound Rep Reg，1998;6:2837.