原代培養的惡性膠質瘤細胞表達死亡受體與TRAIL抵抗的關系

南栗巖 齊 玲 肖振晶 趙慶旭 王 偉 于洪泉 (吉化集團公司總醫院藥劑科，吉林 吉林 30)

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族中的一員，作為腫瘤治療的新藥，在美國已進入臨床Ⅱ期試驗階段〔1〕。但由于在腫瘤治療研究中，TRAIL一直存在治療抵抗，因此，本文對原代培養的惡性膠質瘤細胞進行研究，通過觀察TRAIL的兩種受體——死亡受體(DR)4、DR5在惡性膠質瘤細胞中的表達，探討在原代培養腫瘤細胞中存在的TRAIL抵抗問題。

1 材料與方法

1.1 細胞培養〔2〕取新鮮人腦膠質瘤組織(吉林大學第一醫院提供，病理診斷為Ⅲ～Ⅳ級腦膠質瘤)。將組織剪成小塊(1 mm×1 mm)，置于離心管中，加入0.25%胰酶，37℃恒溫水浴中孵育30 min，離心后棄上清，培養液重懸細胞，苔盼藍計數活細胞，加入10%DMEM/F12(Gibco)培養液，以1×106個/75 cm2密度接種細胞，將培養瓶置入37℃、5%CO2孵箱、飽和濕度下進行培養，隔日換液，1∶3傳代，獲得3株惡性膠質瘤細胞株(GC417、GC321、GC125)。

1.2 免疫印跡檢測惡性膠質瘤細胞中神經分裂癥斷裂基因(DISC)成分的表達〔3〕將細胞培養3 d，待細胞生長90%左右，棄培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌細胞，棄PBS，0.25%胰酶消化，將細胞收集于1.5 ml離心管中，3 000 r/min離心5min，棄上清。PBS充分洗滌細胞，離心棄上清，每個樣品加入50 μl的細胞裂解液，細胞充分裂解后，12 000 r/min 4℃離心15 min，上清移于另一管中，棄沉淀，Braford法檢測樣品蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)跑膠分離樣品，4℃轉膜封閉后，加入相應一抗〔兔抗人死亡受體(DR)5多克隆抗體;兔抗人DR4多克隆抗體;兔抗人β-actin多克隆抗體;1∶1 000〕4℃孵育過夜。加入相應的二抗，室溫、避光孵育1 h，膠片曝光拍照。

2 結果

Western印跡結果顯示，在三株原代培養的惡性膠質瘤細胞株中，死亡受體DR5表達略有不同，GC321表達量明顯高于其他兩株細胞，GC125和GC417表達則明顯減少。在三株細胞中DR4的表達差別不明顯。見圖1。

圖1 惡性膠質瘤細胞表達DR5、DR4情況

3 討論

TRAIL自發現至今，一直處于相對較熱的研究狀態。作為腫瘤壞死因子超家族中的一員，TRAIL可由體內的免疫系統細胞正常表達，并具有天然的腫瘤殺傷活性，對正常細胞無明顯毒性作用〔1〕。國內外已進行了很多關于TRAIL的研究，但現在困擾科研人員的難題之一就是其在多種腫瘤研究過程中出現TRAIL抵抗現象。腦腫瘤是病死率最高的腫瘤之一，惡性腫瘤占70%以上〔4〕。很多膠質母細胞瘤細胞株及原代培養的膠質母細胞瘤對TRAIL誘導凋亡存在抵抗，并且發表許多關于抵抗方面的報道〔5～7〕。到目前為止，對于TRAIL在腦膠質瘤細胞中產生抵抗的機制還不十分清楚，國內對此研究較少，因此，本實驗對原代培養的惡性膠質瘤表達DR5、DR4情況進行研究，初步探討其表達與細胞凋亡之間的關系。

TRAIL受體有五種，包括:DR-DR4、DR5，誘捕受體(decoy receptor，DcR)-DcR1、DcR2 及護骨素(osteoprotegerin，OPG)。DR4、DR5均為Ⅰ型膜蛋白，含有兩個結構域，一個胞外富含半胱氨酸區域(cysteine-rich domain，CRD)，它與 TRAIL結合;另一個胞漿內的死亡結構域(death domain，DD)，能夠傳遞死亡信號，誘導腫瘤細胞凋亡。DcR1、DcR2及OPG與DR相似，但缺乏功能性細胞內死亡結構域，均不能傳遞死亡信號。正常組織和細胞中表達DcR1、DcR2，與DR競爭結合TRAIL，所以TRAIL對正常的組織和細胞無明顯毒性作用〔8，9〕。DR4和 DR5與TRAIL特異性結合后，可通過胞漿內的 DD激發并傳遞凋亡信號。

本實驗采用原代培養的膠質母細胞瘤細胞株GC321、GC417、GC125，這三株細胞對TRAIL的反應性不同，GC321敏感，GC417不敏感，而GC125介于前兩者之間。Western印跡顯示，在三株原代培養的惡性膠質瘤細胞株中，DR5表達略有不同，GC321表達量明顯高于其他兩株細胞，GC125和GC417表達則明顯減少;DR4的表達差別不明顯。這說明可能DR5表達與原代培養的惡性膠質瘤細胞對TRAIL的敏感性相關，但是否還有TRAIL傳導通路中其他因素影響細胞發生凋亡，還需要深入研究。

1 Bellail AC，Qi L，Mu lligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Rev Recent Clin Trials，2009;4(1):34-41.

2 齊 玲，金 宏，丁麗娟，等.腦腫瘤干細胞的培養及生物學特性研究〔J〕.中國實驗診斷學，2011;15(2):227-8.

3 齊 玲，于洪泉，丁麗娟，等.Caspase-8在膠質母細胞瘤抵抗TRAIL誘導凋亡中的作用〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2011;37(4):612-6.

4 Sathornsumetee S，Reardon DA，Desjardins A，et al.Molecularly targeted therapy for malignant glioma〔J〕.Cancer，2007;110(1):13-24.

5 Bellail A，Tse MC，Song JH，et al.DR5-mediated DISC controls caspase-8 cleavage and initiation of apoptosis in human glioblastomas〔J〕.J Cell Mol Med，2010;14(6A):1303-17.

6 Xiao C，Yang BF，Asadi N，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand-induced death-inducing signaling complex and its modulation by c-FLIP and PED/PEA-15 in glioma cells〔J〕.J Biol Chem，2002;277(28):25020-5.

7 Song JH，Bellail A，Tse MC，et al.Human astrocytes are resistant to Fas ligand and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis〔J〕.J Neurosci，2006;26(12):3299-308.

8 Griffith TS，Anderson RD，Davidson BL，et al.Adenoviral-mediated transfer of the TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2 ligand gene induces tumor cell apoptosis〔J〕.J Immunol，2000;165(5):2886-94.

9 Almasan A，Ashkenazi A.Apo2L/TRAIL:apoptosis signaling，biology，and potential for cancer therapy〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2003;14(3-4):337-48.