IFN-α對老年女性丙型病毒性肝炎患者Th1/Th2型細胞因子的影響

劉 平 李建團 穆懷暢 劉金霞 (承德醫學院，河北 承德 067000)

干擾素-α(IFN-α)聯合病毒唑是目前常用的也是較為有效的治療慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)的方法。然而，其骨髓抑制、抑郁、甲狀腺功能異常等嚴重不良反應，常影響患者的依從性和治療效果，尤其在老年女性患者，甲狀腺功能減退發生率明顯高于男性和青年患者〔1〕，甚至發生老年抑郁。本研究通過檢測CHC患者應用IFN-α過程中外周血單個核細胞內輔助性T細胞亞群(Th1/Th2)細胞因子的表達水平，探討IFN-α對Th1/Th2細胞因子表達的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2006～2008年在我科門診或住院病房行IFN治療的54例CHC患者，其中男30例，女24例;年齡18～65〔平均(35.6±16.8)〕歲。在男性患者中，50～65歲15例設為老年男性組;在女性患者中，50～65歲13例設為老年女性組;18～50歲26例設為中青年組。既往無精神疾病及其他身心疾病等遺傳疾病史。治療前進行血、尿常規、肝功能、丙肝病毒(HCV)抗體、HCV RNA、甲狀腺功能、腎功能、血糖、自身免疫相關項目等詳細檢查，嚴格按照中華人民共和國衛生行業標準《丙型病毒性肝炎診斷標準及處理原則》選擇研究對象，排除其他肝炎病毒和免疫缺陷病毒(HIV)感染〔2〕。另外選擇同期體檢的正常人血清20人份，作為正常對照組。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 應用聚乙二醇(PEG)-IFNα-2a 180 μg，每周1次，皮下注射。治療過程中嚴密監測患者用藥后不良反應，出現自身免疫病、骨髓抑制等嚴重不良反應需被迫停藥者，排除在統計分析范圍內。所有病例在應用IFN外均應用相似的保肝降酶治療藥物，在治療觀察期間沒有服用其他對甲狀腺水平有影響的藥物，飲食等。用藥時間48 w。

1.2.2 標本留取 分別在治療前和治療12 w時空腹抽取患者靜脈血10 ml，分離外周血單個核細胞，液氮中保存，備用。

1.2.3 Th1/Th2細胞因子檢測 采用細胞總RNA提取Trizol試劑試劑盒，嚴格按操作指南提取總RNA，核酸蛋白分析儀測定提取總RNA的濃度，應用2 μg總RNA，在20 μl體系中合成cDNA第一條鏈，體系如下:10× buffer2μl，2.5mmol/LdNTP0.25 μl，Oligo(dT)15 primer 1 μl，M-MLV 200 U，RNA 酶抑制劑0.5 μl，42℃ 1 h，92℃ 5 min，滅活逆轉錄酶。β-肌動蛋白(β-actin)、干擾素-γ(IFNγ)、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-10引物由上海生工合成，見表1。用所得cDNA進行RT-PCR 反應，擴增內參照 β-actin 及 IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10的PCR反應條件見表1〔3〕。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶顯色，凝膠成像系統進行照相，Gel-PRO ANALYZER凝膠定量分析軟件進行灰度分析，得β-actin及4種細胞因子灰度值，將4種細胞因子灰度值分別除以β-actin灰度值，從而得到4種細胞因子相對含量(%)。

表1 PCR引物、擴增片段大小及擴增條件

1.3 統計學方法 應用SAS8.0統計軟件，數據資料以±s表示，采用t檢驗。

2 結果

2.1 CHC患者治療前與正常對照組Th1/Th2細胞因子表達水平的比較 CHC患者與正常對照組比較，Th1細胞因子表達水平較低，而Th2細胞因子表達水平偏高。見表2。

2.2 CHC患者治療12 w后與正常對照組Th1/Th2細胞因子表達細胞因子水平比較 IFN治療12 w后，各組患者之間進行比較，發現老年女性組Th1細胞因子IFN-γ和TNF-α表達水平明顯升高，與老年男性組和正常對照組比較差異有統計學意義，但與中青年組比較差異無統計學意義，甚至IFN-γ顯著降低。見表2。

2.3 CHC治療前后各組Th1/Th2細胞因子表達水平的變化 IFN-α聯合病毒唑治療12 w時Th1類細胞因子IFN-γ和TNF-α的表達水平顯著增高，Th2類細胞因子IL-4和IL-10的表達水平與治療前相比無顯著性變化。見表2。

表2 CHC患者治療前和治療12 w后Th1/Th2表達水平的變化(± s，%)

表2 CHC患者治療前和治療12 w后Th1/Th2表達水平的變化(± s，%)

與治療前比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與老年女性組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;與正常對照組比較:5)P＜0.05，6)P＜0.01;與老年男性組比較:7)P＜0.05

組別 n IFN-γ治療前 治療后TNF-α治療前 治療后IL-4治療前 治療后IL-10治療前 治療后正常對照組 20 27.29±5.26 － 24.13±3.55 － 10.0 7±3.33 － 15.52±3.21 －老年女性組 13 19.97±3.256)24.34±5.371)5)18.99±2.386)29.34±5.322)6)8.37±1.695) 9.38±2.38 13.64±3.65 14.30±3.25老年男性組 15 18.31±4.286)22.35±3.562)3)6)21.35±5.245)26.66±3.292)5)10.37±2.054) 9.68±2.25 12.37±2.696) 13.98±2.54中青年組 26 25.54±3.873)7)28.34±3.452)4)22.35±3.843)28.39±4.382)6)12.39±3.264)5)13.34±2.974)6)11.37±3.034)6)13.04±3.085)

3 討論

CD4+T細胞在宿主抗病毒的免疫應答中發揮重要作用，根據細胞因子分泌模式的差異，可分為Th1、Th2兩類。Th1細胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等細胞因子，參與細胞免疫反應;Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子，參與體液免疫反應。IFN在發揮抗病毒治療過程中，能夠激起強的Th1和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應，則病毒被清除;而弱的Th1反應常伴隨著病毒的持續感染和治療失敗〔4，5〕。然而，與此同時，伴隨著Th1和Th2細胞因子誘導的免疫反應相互抑制、相互調節，處于動態平衡狀態被打破，機體不能維持正常的細胞免疫和體液免疫功能。IFN-γ主要由Th1細胞產生，可上調甲狀腺濾泡細胞主要組織相容抗原大分子的表達，介導細胞免疫，促進甲狀腺內淋巴細胞浸潤，并使浸潤的淋巴細胞和巨噬細胞激活并釋放IFN-α、IL-1、IL-6等細胞因子及產生氧自由基，從而造成甲狀腺組織的破壞。IL-4主要產生于Th2細胞，可促進IgG2、IgA和IgE等抗體的產生，介導體液免疫，最終發生自身免疫性疾病〔6〕。

在本研究中，使用半定量RT-PCR方法，從基因表達水平檢測Th1/Th2平衡的變化，即用外周血單核細胞中相對恒量表達的β-actin為內參照，將細胞因子基因與β-actin基因同時進行PCR擴增后，根據細胞因子基因與β-actin基因擴增產物量的比值估算細胞因子基因的相對含量。該方法能夠精確地反映機體免疫功能受到的調節。檢測結果發現，在抗病毒治療前，老年女性CHC患者IFN-γ、TNF-α的表達均明顯低于正常對照組、老年男性組和中青年組。提示CHC患者的細胞免疫功能下降，病毒清除能力減弱，這可能是造成HCV持續感染的原因之一。對IFN-α聯合病毒唑治療12 w時的患者進行分組分析，發現老年女性組Th1類細胞因子IFN-γ和TNF-α的表達水平顯著增高。提示抗病毒治療充分激活了完全應答組的Th1型免疫反應，患者的細胞免疫功能得到恢復，并因此獲得了良好的治療效果。

1 王欣怡，張學敏，張文彬，等.干擾素致老年丙型肝炎患者抑郁與甲狀腺功能低下的關系〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(9):1194-5.

2 彭文偉.傳染病學〔M〕.第5版.北京:人民衛生出版社，2001:15-45.

3 Tsai SL，Sheen IS，Chien RN，et al.Activation of Th1 immunity is a common immune mechanism for the successful treatment of hepatitis B and C:tetramer assay and therapeutic implications〔J〕.J Biomed Sci，2003;10(1):20-35.

4 Abayli B，Canataroglu A，Akkiz H.Serum profile of T helper 1 and T helper 2 cytokines in patients with chronic hepatitis C virus infection〔J〕.Tark J Gastroenterol，2003;14(1):7-11.

5 Aghemo A，Rumi MG，Colombo M.Pegylated IFN-alpha2a and ribavirin in the treatment of hepatitis C〔J〕.Expert Rev Anti Infect Ther，2009;7(8):925-35.

6 張文彬，王欣怡，劉金霞.聚乙二醇干擾素致老年女性丙型病毒性肝炎患者抑郁癥狀分析〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(11):1495-6.