補腎方藥對老年大鼠血清皮質酮含量、LTP及空間學習記憶能力的影響

康湘萍 金國琴 董獻文 龔張斌 徐品初 (上海中醫藥大學基礎醫學院生物化學教研室，上海 003)

衰老是生物界普遍存在的一種自然現象，在衰老的進程中，機體出現各種生理功能下降或紊亂，其中最顯著的特征之一是增齡性的學習記憶能力減退。有關衰老尤其是腦老化的機制學說有很多，根據本課題組前期的研究〔1〕及近年來國內外的實驗表明〔2，3〕，糖皮質激素(GC)的細胞毒性作用與衰老相關的認知能力降低密切相關。衰老過程中下丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸功能失調可引起GC分泌過多，反饋作用于海馬區域的糖皮質激素受體(GCR)，對海馬結構和功能產生毒性作用，從而導致學習記憶能力的減退。中醫認為“腎藏精，主骨生髓”，腎精虛衰在衰老中具有重要地位。故本實驗以中醫衰老腎虛理論為指導，以自然衰老大鼠為動物模型，采用ELISA法、電生理技術及Morris水迷宮法觀察補腎方藥(左歸丸、右歸丸)對老年大鼠血清皮質酮含量、LTP及空間學習記憶能力的影響，以進一步探討補腎方藥改善老年人認知障礙的作用機制，為臨床運用該方藥延緩衰老提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 左歸丸和右歸丸用《景岳全書》原方。左歸丸由熟地黃20 g、山藥10 g、菟絲子10 g、枸杞子10 g、山茱萸10 g、牛膝7.5 g、龜板膠10 g、鹿角膠10 g組成;右歸丸由熟地黃 24 g、山藥12 g、枸杞子12 g、山茱萸9 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、杜仲12 g、當歸9 g、肉桂6 g、附子6 g組成，以上藥物均購自上海康橋中藥飲片有限公司。將各方藥按傳統方法水煎成劑，并加以濃縮，－30℃保存，臨用前稀釋飲用。

1.2 實驗動物造模及分組 12月齡雄性SD大鼠，清潔級，上海中醫藥大學實驗動物中心提供〔動物許可證號:SCXK(滬)2008-0016〕。隨機分為4組:老年對照組、老年GC拮抗組、老年左歸組和老年右歸組，另設青年對照組。自21月齡起分別給老年左歸組及老年右歸組大鼠飲用左歸丸和右歸丸藥液(劑量相當于臨床成人每公斤體重劑量的10倍)，連續3個月，每周飲藥液5 d，停藥2 d;老年GC拮抗組于水迷宮及LTP實驗前2 ～3 h，皮下注射 RU38486(5 mg/kg)〔4〕。

1.3 試劑與儀器 血清皮質酮ELISA試劑盒(美國ADL公司)，Morris水迷宮測試分析軟件(荷蘭Noduls公司)，江灣ⅠC型腦立體定位儀(上海川沙花木農機廠)，Escort-Ⅲ牙科鉆(韓國SAEYANG公司)，RM6240型生物信號采集系統(成都儀器廠)。

1.4 空間學習記憶能力測試 采用Morris水迷宮法〔5〕。實驗前動物自由游泳2 min。平臺設于迷宮西南象限正中(訓練期間平臺位置固定)，水面高出平臺1.5 cm，水溫保持在19℃ ～20℃。大鼠連續訓練5 d，每天2次，分別從正北、正東兩個起始點投放，設定最長游動時限為70 s，電腦自動計時，記錄大鼠找到平臺所需要的時間，即潛伏期(s)。如果大鼠70 s內未能找到平臺，潛伏期記為70 s;同時將其引至平臺上，在平臺上停留20 s。記錄每天各組大鼠兩次潛伏期的時間(s)，取均值進行統計學評價。

1.5 海馬CA1區LTP的檢測〔6〕

1.5.1 電極安裝與定位 大鼠以20%烏拉坦(1.5 g/kg)麻醉，并固定于立體定位儀上。常規手術暴露顱骨，參照大鼠腦立體定位圖譜確定記錄電極及刺激電極的坐標定位:記錄電極位于CA1區輻射層，坐標為前囟后3 mm，旁開2.5 mm，深度根據場電位特征，一般約為2 mm左右;刺激電極位于同側海馬CA3 Schaffer側支處，坐標為前囟后4.2 mm，旁開3.8 mm，深度根據刺激誘發波形調整，一般約為3.8 mm左右。在上述坐標部位鉆直徑為1.5 mm的小孔，分別埋置記錄電極及刺激電極，調整刺激電極和記錄電極的位置，找到以固定強度的刺激記錄到最大的群峰電位(PS)時將電極固定。以上操作均在屏蔽籠內完成。

1.5.2 基礎對照記錄和LTP的誘導 測試刺激由電子刺激器產生，單刺激采用高級刺激模塊中的自動多串刺激。參數:波寬0.1 ms，脈沖數1個，刺激強度為最大誘發波所用刺激強度的1/3，一般為5 V左右，循環60次，循環間隔為30 s。待上述基礎記錄穩定30 min后，再給予可以誘發LTP的高頻刺激(HFS)。具體刺激方案為:串單刺激，波寬0.1 ms，波間隔10 ms，延時20 ms，脈沖100個，所用刺激強度與單刺激相同。HFS后用上述單刺刺激進行檢測，如果PS幅度較自身對照值增加30%以上且持續時間超過30 min，則表明LTP現象已經形成，連續觀察記錄60 min。

1.5.3 數據分析處理〔7〕每次測試單次刺激均可誘發出1個PS，將連續10個PS幅值疊加處理后的平均值作為一個時間點的PS幅值。以HFS前記錄的6個時間點的PS幅值的平均值作為自身基礎幅值，HFS后每個時間點的PS幅值與之比較得出的相對值(%)表示。

1.6 血清皮質酮含量的測定 大鼠麻醉后于腹主動脈取血，置于離心管內，室溫下3 000 r/min，離心10 min，取上清液置于－80℃冰箱保存。采用ELISA法檢測皮質酮含量，按說明書操作，美國BIO-TEX全自動酶標儀(ELX800)檢測吸光度，吸光度的檢測波長為450 nm。

1.7 統計學處理 采用SPSS12.0軟件，所有數據均以±s表示，組間比較采用t檢驗;水迷宮檢測數據采用重復測量數據的方差分析方法進行統計〔8〕。

2 結果

2.1 補腎方藥對老年大鼠空間學習記憶能力的影響 各組大鼠隨著訓練次數的增多，找到平臺所需的時間(潛伏期)呈逐漸縮短趨勢。從訓練的第2天起，老年對照組大鼠潛伏期較青年對照組明顯延長(P＜0.05)，老年左歸組較老年對照組潛伏期顯著縮短(P＜0.05);從第3天起，老年右歸組和老年GC拮抗組大鼠潛伏期較老年對照組亦明顯縮短(P＜0.05)。提示老年大鼠空間學習記憶能力逐漸減退，補腎方藥左歸丸、右歸丸及拮抗劑Ru38486對衰老大鼠的空間學習記憶減退均有一定的改善作用。見表1。

2.2 補腎方藥對老年大鼠HFS誘導LTP的影響 與青年對照組比較，老年對照組大鼠海馬CA1區LTP受到明顯抑制(P＜0.05)，左歸丸能顯著減輕該抑制作用;右歸丸從HFS誘導LTP后的第20分鐘開始，亦可顯著改善該抑制作用(P＜0.05);拮抗劑RU38486對LTP的抑制作用存在一定的改善趨勢，除第50分鐘時存在顯著性差異外，其余各時段差異無統計學意義。見圖1。

2.3 補腎方藥對老年大鼠血清皮質酮含量的影響 老年對照組大鼠血清皮質酮(ng/L)含量(195.13±10.80)較青年對照組(71.89±7.63)明顯升高(P＜0.05)，老年GC拮抗組(82.55±7.71)和老年左歸組(141.61±8.86)大鼠血清皮質酮含量(141.59±15.29)較老年對照組顯著降低(均P＜0.05)，老年右歸組大鼠血清皮質酮含量相對老年對照組有降低趨勢，但是無統計學意義(P＞0.05)。提示老年大鼠體內存在高皮質酮現象，而補腎方藥及RU38486對該現象存在一定的改善作用。

表1 補腎方藥對老年大鼠空間學習記憶能力的影響(±s)

表1 補腎方藥對老年大鼠空間學習記憶能力的影響(±s)

與青年對照組比較:1)P＜0.05;與老年對照組比較:2)P＜0.05

組別 n潛伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天 第5天青年對照組 10 64.5±7.34 55.7±9.37 42.3±8.49 33.6±7.52 24.7±4.97老年對照組 10 70.0±0.00 68.8±2.571) 65.0±6.111) 63.0±6.061) 60.4±7.041)老年GC拮抗組 10 68.1±4.33 61.2±7.51 53.4±5.952) 46.6±3.862) 42.2±3.552)老年左歸組 10 67.1±4.50 58.8±8.382) 51.6±6.382) 45.3±4.832) 39.8±3.292)老年右歸組 10 68.9±2.33 60.2±8.39 49.5±3.372) 42.7±3.232) 39.7±2.502)

圖1 補腎方藥對HFS誘導大鼠海馬CA1區LTP的影響

3 討論

隨著衰老，學習記憶能力逐漸下降，隨之產生的各種與此相關的老年性認知缺陷和障礙疾病嚴重影響老年人的生存質量，也給社會家庭帶來沉重的負擔。據聯合國的預測〔9〕，到2010年，中國60歲及65歲以上人口比分別為12.3%和8.1%，2020年更將達到16.7%和11.5%，表明我國已經進入人口老齡化國家行列。因此，研究衰老時學習記憶減退的機制，尋找預防老年智力退化的藥物是當前醫藥界面臨的一個重要任務。

眾所周知，學習記憶的神經生物學基礎是神經細胞之間突觸的可塑性變化，而海馬是最早被認為在學習記憶過程中起關鍵作用的中樞結構〔10〕。1973年 Bliss等〔11〕首次記錄到長時程突觸傳遞增強現象(即LTP);在此基礎上，越來越多的資料顯示〔12，13〕，LTP是研究學習和記憶的神經元可塑性的最好模型，可能是學習和記憶的神經基礎，并作為神經科學研究當中衡量突觸可塑性的一個主要的電生理指標。Morris水迷宮則是檢測大鼠空間學習記憶的常用裝置，其檢測到的記憶是一種空間參考記憶;從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶屬于陳述性記憶，而臨床健忘和癡呆的病人，正是陳述性記憶受損明顯。在Morris水迷宮和LTP實驗中筆者觀察到老年大鼠空間學習記憶明顯減退，其海馬CA1區LTP同樣受到明顯抑制，而左歸丸、右歸丸及皮質酮受體拮抗劑RU38486均不同程度地對老年大鼠神經元可塑性的退行性變化有一定的改善作用。

大腦邊緣系統——海馬在衰老進程中是最易受到影響的腦區之一，與學習記憶能力退化密切相關〔14〕。導致這種變化的原因之一可能是長期的高濃度糖皮質激素(GC)對它的損害作用〔15〕，因為海馬區域含有豐富的GC受體，這就使得海馬區域成為老年性高水平皮質激素毒性的重要靶位。有研究表明，在人類或者嚙齒類動物的正常老化過程中可以觀察到一系列HPA負反饋作用減弱的表現，諸如糖皮質激素的基礎水平增高，海馬萎縮以及認知障礙〔16，17〕，雖然糖皮質激素水平增高并非年齡老化的一個恒定特征，但確實與衰老加速過程中的認知功能減退相關〔17〕。本文的研究結果表明，老年大鼠血清皮質酮含量較青年對照組明顯升高，補腎方藥左歸丸、右歸丸能不同程度降低老年大鼠異常增高的皮質酮水平，減輕皮質酮對于海馬的毒性作用，改善老年大鼠的學習記憶能力;同時，皮質酮受體拮抗劑RU38486同樣能夠顯著降低老年大鼠血清皮質酮含量，提高老年大鼠的學習記憶能力，推測可能與其減弱GC對海馬神經細胞GCR的毒性作用有關〔15，18〕。

從中醫的角度來看，老年性學習記憶的減退屬于“呆癥”和“健忘”范疇，其病位在腦而本于腎。腎藏精生髓，腦為髓之海。腎強髓充則元神精湛而記憶不怠;髓海不足，腦失充養，則神明呆滯而引起學習記憶功能減退甚至障礙。清代王清任說:“人之靈機記憶皆在腦”，表明腎與腦的記憶功能關系密切。左歸丸和右歸丸是明代張景岳根據陰陽互根原理研制的“滋補腎陰”和“溫補腎陽”的經典補腎方藥〔19〕，二方皆可通過補腎益髓之功改善老年性學習記憶減退的表現，究其作用機制，可能與拮抗高濃度皮質酮對海馬神經元的損傷有關，深入的分子機制有待于進一步的研究。

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