解毒祛瘀滋陰方對MRL/lpr小鼠粘附分子表達的影響

[摘要] 目的 探討解毒祛瘀滋陰方可能的作用機制。方法 以MRL/lpr小鼠80只，分成4組采用RT-PCR技術檢測各組腎組織ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達水平。結果 解毒祛瘀滋陰方合用激素組ICAM-1和VCAM-1mRNA表達低于其他各組。結論 解毒祛瘀滋陰方合用激素能有效降低MRL/lpr小鼠腎組織ICAM-1和VCAM-1mRNA表達水平。

[關鍵詞] ICAM-1;VCAM-1

[中圖分類號] R25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)06-22-02

Effect of Detoxification-Stasis Removing-Yin Nourishing Recipe on mRNA Expression of ICAM-1 and VCAM-1 in MRL/lpr Mice

YANG Kepeng1FAN Yongsheng2WANG Xinchang2WEN Chengping2

1.Zhengzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450007，China;2.The China university of Zhejiang，Hangzhou 310053，China

[Abstract] Objective To study the effect of detoxification-stasis removing-Yin nourishing (DSY) recipe on the mRNA expression of ICAM-1 and VCAM-1 in renal tissue in MRL/lpr mice. Methods We divided 80 MRL/lpr mice into four groups and used RT-PCR to detect the mRNA expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 in the mouse renal tissue in each group. Results The mRNA expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 in the mouse renal tissue were lower in the DSY recipe plus hormone group than those in other groups. Conclusion The DSY recipe plus hormone can effectively reduce the mRNA expression of MRL/lpr mouse kidney tissue ICAM-1 and VCAM-1.

[Key words] ICAM-1;VCAM-1

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種典型的自身免疫性疾病，在我國的患病率約為75/10萬人[1]。解毒祛瘀滋陰方是范永升教授治療系統性紅斑狼瘡臨床經驗的結晶，前期研究表明，能有效調節機體細胞因子及其受體、新喋呤水平、影響淋巴細胞凋亡及Fas基因表達等[2-4]。

1材料與方法

1.1實驗動物

MRL/lpr狼瘡小鼠，雌性，7～8周齡，浙江中醫藥大學動物實驗中心購進。

1.2實驗藥品

中藥復方煎劑，由蚤休15g、青蒿30g、赤芍10g、積雪草15g、生地18g、炙鱉甲10g等12味解毒、祛瘀、滋陰藥配伍而成，水煎，濃縮成生藥含量1.50g/mL，由浙江中醫藥大學制劑室提供。強的松懸液，由強的松片溶于生理鹽水按含藥量0.5mg/mL配制而成。

1.3主要實驗器材

RT-PCR試劑盒購自上海捷蘭生物有限公司;紫外分光光度計 PharmaciaBio公司，瑞典;PCR溫控儀Biometra公司，美國;Tanon 2000紫外分析儀及凝膠圖像分析系統，上海天能公司。

1.4實驗方法

1.4.1分組與用藥隨機將80只MRL/lpr小鼠分成4組，20只/組。模型組灌胃生理鹽水;中藥組灌胃中藥解毒祛瘀滋陰濃縮液;西藥組灌胃強的松混懸液;中西藥組中西藥隔日交替灌胃，均約0.8mL/日。用藥10周后處死，冰上分離雙側腎臟并迅速置液氮中凍存。

1.4.2腎組織ICAM-1、VCAM-1mRNA表達檢測(RT-PCR法)①引物設計由上海生物工程技術服務有限公司合成。引物序列:ICAM-1上游引物CATCCCAAAGCTCGACACCC(732位開始)，下游引物AACATAAGAGGCTGCCATCACG(1599位開始); VCAM-1上游引物GCTCCAGACATTTACCCAGTT(736位開始)，下游引物CACTCTGCCTCTGTTTGGGT(1825位開始); GAPDH上游引物GTGAAGGTCGGAGTCAACG，下游引物GGTGAAGA CGCCAGTGGACTC。②異硫氰酸胍-酚:氯仿一步法提取腎組織總mRNA[5]，-70℃保存;紫外分光光度計測定mRNA的含量;反轉錄;③PCR擴增反應液預變性 94℃ 3min;變性94℃，30s退火，59℃ 30s延伸 72℃ 2min(30個循環);延伸72℃ 10min;4℃保存;電泳;紫外透射儀下查看，并拍照。④圖像處理用Tanon 凝膠圖像分析系統進行光密度掃描，進行半定量統計分析。

1.5統計學方法

實驗數據均以均數±標準差(χ±s)表示。使用SPSS11.5統計軟件包進行各組間和組內前后相關數據的單因素方差分析。

2結果

2.1 各MRL/lpr小鼠組間腎組織ICAM-1mRNA表達水平比較

模型組mRNA表達水平高于其他組，P<0.01;中西藥組較其他組表達水平較低，P<0.01。見表1及圖1。

2.2 各MRL/lpr小鼠組間腎組織VCAM-1mRNA表達水平比較

中藥組、西藥組和中西藥組腎組織VCAM-1mRNA表達水平均低于模型組，僅中藥組比較差異有顯著性，P<0.05;中藥組較其他組表達水平較低。見表2和圖1。

3討論

本病多歸屬于祖國醫學的“陰陽毒”和“日曬瘡”等范疇。我們前期研究也發現了SLE患者性激素水平的紊亂(PRL、E2偏高，T偏低)[2]。因此以臨床經驗為基礎篩選出“生地、蚤休、炙鱉甲、青蒿、積雪草、芡實”等12味解毒祛瘀滋陰藥。全方以生地清熱涼血益陰為君，積雪草、升麻清熱解毒為臣，炙鱉甲補陰益腎退熱，赤芍、丹參活血散血，蚤休調節免疫俱為佐藥，青蒿退熱，疏理少陽氣機，以為使藥[6，7]。臨床上我們以解毒祛瘀滋陰方加減并結合激素治療SLE，取得了較好的協同作用，明顯降低ANA、抗ds-DNA和升高補體C3、血小板等免疫指標水平，改善外周血T細胞亞群比例和改善內分泌及性激素免疫調節環路，同時有利于激素的減量和減少感染、骨質疏松、高脂血癥等并發癥的出現[3，4]。

已有研究表明ICAM-1在腎組織中過多的表達可能加重腎損傷[8]。在自發狼瘡小鼠中ICAM-1的表達與腎臟病變嚴重程度和細胞因子的生成有關，如IL-1、TNF-α等可能介導了腎炎中粘附分子的生成[9]。另有研究證實，VCAM-1也能刺激免疫細胞粘附至腎實質細胞而參與SLE的發病[10]。

本實驗顯示解毒祛瘀滋陰方與激素合用對抑制狼瘡鼠腎組織炎癥具有更為明顯的作用，可能是通過抑制粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達，從而發揮了免疫調節的作用，使病變腎小球炎細胞浸潤減少。

[參考文獻]

[1] 蔣明，David YU，林孝義，等. 中華風濕病學[M]. 北京:華夏出版社，2004:886.

[2] 王新昌，溫成平，范永升. 解毒祛瘀滋陰法對SLE類固醇性血脂異常的防治作用[J]. 浙江中西醫結合雜志，2003，13(6): 336-337.

[3] 溫成平，李學銘. 中藥狼瘡定對SLE患者血清sIL-2R和neopterin水平的影響[J]. 中國中西醫結合雜志，2001，21(5):339-341.

[4] 溫成平，范永升，李學銘. 解毒祛瘀滋陰藥并用激素對SLE性激素水平的調節作用[J]. 中國中西醫結合腎病雜志，2003，4(10):580- 582.

[5] 方肇勤. 分子生物學技術在中醫藥研究中的應用[M]. 上海:上海科學技術出版社，2002:53-58.

[6] 李時珍. 本草綱目[M]. 北京:人民衛生出版社，1982:849-852.

[7] 許德清，曾凡欽. 紅斑狼瘡[M]. 北京:中國醫藥科技出版社，2003:9.

[8] Lloyd CM， Gonzalo JA， Salant DJ， et al. Intercellular adhesion molecular-1 dificiency prolongs survival and protects against the development of pulmonary inflammation during murine lupus[J]. J Clin Invest，1997，100:963-971.

[9] Wenpu Zhao，Seth G，Jeffrey B，et al. The Peroxisome Proliferator -Activated Receptor Agonist Pioglitazone Improves Cardiometabolic Risk and Renal Inflammation in Murine Lupus[J]. The Journal of Immunology，2009，183:2729-2740.

[10] Lena Schiffer，Ramalingam B，Meera R，et al. Activated Renal Macrophages Are Markers of Disease Onset and Disease Remission in Lupus Nephritis1[J]. The Journal of Immunology，2008，180:1938- 1947.

(收稿日期:2009-12-09)