補(bǔ)腎活血方對(duì)血管性癡呆小鼠腦組織BDNF和bFGF含量的影響

于文濤 張一昕 張 杰 (河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 05009)

血管性癡呆(VD)是因腦血管病所致的智能及認(rèn)知功能障礙，為老年人常見病、多發(fā)病。補(bǔ)腎中藥和活血中藥為臨床治療VD最常用藥物，具有公認(rèn)的療效〔1〕。為了比較不同治法對(duì)于VD的作用效果，本研究采用反復(fù)腦缺血再灌注的方法復(fù)制VD小鼠模型，觀察補(bǔ)腎類中藥、活血類中藥、補(bǔ)腎活血類中藥對(duì)模型小鼠行為學(xué)及腦組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性昆明小鼠，體重35～40 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證編號(hào):906017。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 補(bǔ)腎方:由何首烏、益智仁、胡桃肉、人參組成。活血方:郁金、川芎、丹參、當(dāng)歸組成。補(bǔ)腎活血方:由何首烏、益智仁、胡桃肉、人參、郁金、川芎、丹參、當(dāng)歸組成。上藥由本院煎藥室煎制，補(bǔ)腎活血方濃縮成1.428 g/ml的混懸液，補(bǔ)腎方、活血方濃縮成0.714 g/ml的混懸液。尼莫地平片:石家莊市華龍藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H13021882。規(guī)格:20 mg/片，使用前用蒸餾水配制成濃度為1.558 mg/ml的藥液。

1.3 主要儀器 小鼠電子水迷宮，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。BDNF和bFGF定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒:上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 分組及給藥 從實(shí)驗(yàn)小鼠中隨機(jī)抽取12只作為假手術(shù)組，其余隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)腎活血組、補(bǔ)腎組、活血組、陽性對(duì)照組，每組15只，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后除去死亡，剩余只數(shù)見表1。各治療組在造模后第2天給藥治療，補(bǔ)腎活血組灌服補(bǔ)腎活血方14.28 g/kg體重，補(bǔ)腎組，活血組均以7.14 g/kg體重灌服相應(yīng)藥物，陽性對(duì)照組灌服15.58 mg/kgod的尼莫地平藥液，假手術(shù)組、模型組均灌服等劑量的生理鹽水，均日1次，治療14 d。

1.5 模型制備 參照文獻(xiàn)〔2〕，除假手術(shù)組外，其余各組小鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸正中部常規(guī)消毒，切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用4號(hào)絲線阻斷血流20 min，同時(shí)在距尾尖1 cm處剪斷尾端，放血約0.3 ml，熱凝止血。松開絲線，恢復(fù)血流再灌注10 min后，再次阻斷血流20 min，如此重復(fù)3次，第3次再灌注后用生理鹽水清洗切口，縫合皮膚，局部注射慶大霉素0.2萬U。假手術(shù)組只分離頸總動(dòng)脈，穿線但不結(jié)扎，并且尾部不放血。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 行為學(xué)檢測(cè) 采用水迷宮測(cè)試。水迷宮為黑色有機(jī)玻璃板制成的水池，分為起始區(qū)、終點(diǎn)區(qū)和三個(gè)盲端。實(shí)驗(yàn)開始之前，設(shè)置水深為22 cm，水溫為(24±1)℃，并引導(dǎo)小鼠從起點(diǎn)區(qū)游至終點(diǎn)區(qū)，共訓(xùn)練3次。訓(xùn)練結(jié)束后，記錄小鼠5 min內(nèi)從起點(diǎn)區(qū)游至終點(diǎn)區(qū)全程所需時(shí)間(5 min內(nèi)未游到終點(diǎn)者，按5 min計(jì))及進(jìn)入盲端次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))，作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后再檢測(cè)游完全程所需時(shí)間及進(jìn)入盲端次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))，作為記憶成績(jī)。

1.6.2 各組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量的變化 斷頭處死小鼠，冰盤上快速取腦，棄去嗅球及小腦，取腦組織稱重，移至玻璃勻漿管中，并加入等倍體積的預(yù)冷生理鹽水，于冰盤上勻漿，充分研碎，使組織勻漿化。制備好的 50%勻漿3 500 r/min離心10 min，提取上清。后采用雙抗體夾心ABCELISA法檢測(cè)腦組織BDNF和bFGF含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料用±s表示，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶成績(jī)的比較 與假手術(shù)組比較，模型組的游全程時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)增加，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。與模型組比較，各治療組學(xué)習(xí)成績(jī)和記憶成績(jī)均有顯著提高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，補(bǔ)腎活血組的學(xué)習(xí)成績(jī)與記憶成績(jī)優(yōu)于其他治療組(P＜0.05或P＜0.01)。表明各組均有提高學(xué)習(xí)記憶能力的作用，而補(bǔ)腎活血組最優(yōu)。見表1。

表1 各組小鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶成績(jī)比較(±s)

表1 各組小鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶成績(jī)比較(±s)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與補(bǔ)腎活血組比較:3)P＜0.05;下表同

組別 n 學(xué)習(xí)成績(jī)游全程時(shí)間(s) 錯(cuò)誤次數(shù)(次)記憶成績(jī)游全程時(shí)間(s) 錯(cuò)誤次數(shù)(次)假手術(shù)組 12 37.08±19.252) 2.66±1.432) 51.83±21.312) 3.08±1.732)模型組 9 136.44±52.47 8.22±3.45 170.55±70.54 9.11±3.29補(bǔ)腎活血組 11 71.45±25.692) 3.72±2.452) 79.91±32.412) 4.18±1.722)補(bǔ)腎組 11 100.09±23.312)3) 5.91±1.811)3) 119.73±44.861)3) 6.36±3.071)3)活血組 11 98.90±28.452)3) 5.73±1.791)3) 123.64±48.451)3) 6.45±1.361)3)陽性對(duì)照組 10 101.00±24.361)3) 6.00±1.881)3) 121.20±47.011)3) 6.50±3.211)3)

2.2 各組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量的比較 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量明顯升高，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)。與模型組比較，各治療組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量均明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01);補(bǔ)腎活血組的BDNF含量高于其他治療組(P＜0.05或P＜0.01)，bFGF含量高于活血組和陽性對(duì)照組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量的比較(±s，ng/g·prot)

表2 各組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量的比較(±s，ng/g·prot)

組別 n BDNF bFGF假手術(shù)組 12 504.85±83.342) 48.73±10.921)模型組 9 815.74±82.65 64.90±18.48補(bǔ)腎活血組 11 1 085.56±188.692) 103.10±21.752)補(bǔ)腎組 11 974.81±92.072)3) 95.49±11.672)活血組 11 919.30±61.391)3) 89.35±13.312)3)陽性對(duì)照組 10 930.48±98.831)3) 86.05±14.132)3)

3 討論

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTF)是由多種細(xì)胞分泌的一類對(duì)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)作用的非常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的代謝和功能活動(dòng)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生修復(fù)發(fā)揮著重要作用〔3〕。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)為NTF家族重要成員，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，具有保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)，活化膠質(zhì)細(xì)胞、修復(fù)血管內(nèi)皮，促進(jìn)新毛細(xì)血管形成等多種生物學(xué)活性〔4〕。

腦缺血發(fā)生后，BDNF不僅能夠支持多種神經(jīng)元的存活、發(fā)育、分化和損傷后修復(fù)，還可以通過調(diào)節(jié)組織突觸可塑性，誘發(fā)和維持組織和皮質(zhì)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)而參與學(xué)習(xí)記憶過程，改善受損的學(xué)習(xí)記憶能力〔5〕。研究顯示，與非認(rèn)知障礙腦梗死患者相比，血管性認(rèn)知障礙患者血清BDNF水平明顯增高〔6〕，證明BDNF參與了腦梗死進(jìn)展為認(rèn)知障礙的病理生理過程。實(shí)驗(yàn)研究顯示〔7，8〕，腦缺血后，VD大鼠腦組織的BDNF表達(dá)明顯增多，直至15 d后腦組織BDNF陽性細(xì)胞逐漸減少，BDNF的升高對(duì)缺血后腦神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化具有促進(jìn)作用。bFGF是一種具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞存活，以及新毛細(xì)血管形成等多種生物學(xué)活性的多肽物質(zhì)。腦缺血時(shí)，腦皮質(zhì)和海馬的bFGF表達(dá)會(huì)顯著增強(qiáng)，促使腦組織bFGF含量增加，通過擴(kuò)張血管和選擇性地開放因缺血而關(guān)閉的微血管，提高腦血流量，改善局部缺血狀態(tài)，并能促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)，改善缺血造成的學(xué)習(xí)及記憶下降〔9〕。研究顯示〔10〕，給予VD大鼠皮下注射外源性的bFGF，bFGF能遷移至海馬，誘導(dǎo)海馬產(chǎn)生巢蛋白(nestin)陽性細(xì)胞，刺激VD大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖，修復(fù)受損組織，改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。研究表明〔11〕，bFGF尚可通過調(diào)節(jié)腦神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和DA含量，從而改善VD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

VD屬于中醫(yī)“健忘”、“呆病”范疇。中醫(yī)認(rèn)為本病病位在腦，涉及肝腎心脾，其病機(jī)為髓海空虛，腦脈瘀阻，故治當(dāng)以填補(bǔ)腎精治其本，祛瘀通絡(luò)治其標(biāo)，補(bǔ)腎活血恰合病機(jī)。通過觀察補(bǔ)腎方、活血方、補(bǔ)腎活血方對(duì)VD模型小鼠行為學(xué)及腦組織BDNF和bFGF含量的影響。結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血組在促進(jìn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和提高BDNF含量方面均顯著優(yōu)于補(bǔ)腎組和活血組，在調(diào)節(jié)bFGF含量方面明顯優(yōu)于活血組。

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