D-半乳糖致衰老模型大鼠腦組織Ach活性、NGF表達變化及山茱萸多糖的干預作用

周少丞 韓曉明 王力冬 康 琦 燕 鬧 于永春 歐 芹

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

許多學者已將腦內乙酰膽堿 (Ach)的含量、膽堿乙酰轉移酶 (ChAT)活性和膽堿酯酶 (AchE)活性作為人類腦功能衰老研究的主要指標，也作為探討阿茨海默病 (AD)藥物治療機制的重要方面〔1，2〕。目前研究表明，Ach代謝失調所致生化改變是中樞神經系統衰老的重要因素之一〔3，4〕。山茱萸多糖是山茱萸的主要成分，具有提高衰老小鼠抗氧化能力、降低一氧化氮 (NO)及其合酶 (NOS)及白細胞介素-6(IL-6)水平，提高IL-1、IL-2水平的作用〔5，6〕;體外實驗證實其還能顯著降低衰老人胚肺二倍成纖維 (HDF)細胞β-半乳糖苷酶、P16、細胞周期蛋白因子-1(cyclinD1)的表達，提高熱休克蛋白70(HSP70)、周期素依賴性激酶4(CDK4)表達水平，減輕細胞DNA損傷〔7，8〕。本實驗旨在探討D-半乳糖衰老模型大鼠神經生長因子 (NGF)和AchE活性的變化，以及山茱萸多糖對抗腦衰老作用的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 山茱萸購自佳木斯寶泰醫藥大藥房，由本校生藥教研室鑒定。腦脂褐素(LP)和AchE測試盒為南京建成生物公司產品，RT-PCR試劑盒為大連寶生物有限公司提供，引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。山茱萸多糖的制備參照李平等〔9〕方法，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，并制成0.05 g/ml的水溶液備用。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 純系Wistar大鼠46只，雌雄各半，2～3月齡，體重(225±25)g，由佳木斯大學動物實驗中心提供。隨機分為3組，青年對照組(QN，12只)、衰老模型組(SL，12只)、山茱萸多糖給藥組24只，其中給藥組分為小劑量組(FCPS，12只)和大劑量組(FCPL，12只)，大鼠適應2 w后開始實驗。QN每日上午側腹部皮下注射生理鹽水，劑量參照其他給藥組 D-半乳糖給藥量，SL和給藥組按48 mg·kg－1·d－1皮下注射D-半乳糖42 d后，SL經胃給予相當于給藥組藥量體積的溫開水，FCPS和FCPL分別按照0.14 g/kg體重、0.28 g/kg體重經胃給藥，連續給藥30 d。于末次給藥后次日處死大鼠，4℃取腦皮質，分兩份分別用于制備10%組織勻漿和液氮中保存備用。

1.2.2 指標檢測 LP采用熒光分光光度法，考馬斯亮藍法測蛋白質含量，LP以μg/g組織表示。AchE活性采用分光光度法，以U/mg蛋白表示。Trizol常規提取總RNA，瓊脂糖電泳法檢測RNA完整性，Beckman DU-800紫外檢測RNA含量。RTPCR法檢測NGF mRNA表達，以β-肌動蛋白(β-actin)作內參，反轉錄條件:52℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，1 個循環;然后行 PCR。NGF上游引物:5'-GATCGGCGTACAGGCAGAAC-3'，下游引物:5'-GGCTCGGCACTTGGTCTCAA-3'，擴增片段長度504 bp;β-actin引物:上游引物:5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游引物:5'-TTCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'，擴增片段長度207 bp。PCR反應體系:5×PCR 緩沖液 10 μl，滅菌蒸餾水32.75 μl，Taq 酶 0.25 μl，上游引物和下游引物各 1 μl，反轉錄產物 5 μl;PCR 條件:94℃ 2 min ，1個循環;94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 1 min，29個循環。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠80 V電泳1.2 h，溴乙錠(EB)染色，采用凝膠成像系統分析，以ODNGF/ODβ-actin表示NGF mRNA表達水平。

1.3 統計學分析 應用SPSS11.0統計軟件，實驗數據以±s表示，數據統計采用方差分析，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 山茱萸多糖對衰老模型大鼠腦LP含量和AchE活性的影響 SL和給藥組大鼠LP含量均明顯高于QN(P＜0.01);兩給藥組LP均較SL大鼠明顯降低(P＜0.05，P＜0.01);其中FCPL與FCPS有顯著差異(P＜0.05)。SL大鼠AchE活性顯著升高(P＜0.01);兩給藥組AchE明顯低于SL大鼠(P＜0.05，P＜0.01)，其中FCPL降低更顯著(P＜0.01);SL、FCPS和FCPL大鼠AchE活性明顯高于QN大鼠(P＜0.01，P＜0.05)，差異有統計學意義。見表1。

2.2 D-半乳糖對大鼠腦NGF表達的影響及山茱萸多糖的作用 SL和FCPL、FCPS大鼠腦皮層NGF mRNA表達(0.426±0.056，0.537±0.047，0.615±0.051)均明顯低于 QN(0.728 ±0.071)(P ＜0.01，P ＜0.05);而 FCPL、FCPS則明顯高于 SL(P＜0.01，P＜0.05)，其中以 FCPL組表達降低較顯著(P＜0.05)。見圖1。

表1 山茱萸多糖對衰老模型大鼠LP含量和AchE活性的影響(±s)

表1 山茱萸多糖對衰老模型大鼠LP含量和AchE活性的影響(±s)

與青年組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與衰老模型組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;與小劑量組比較:5)P ＜0.05，6)P ＜0.01

組別 n LP(μg/g組織) AchE(U/mgpro)青年對照組(QN)12 1.329±0.128 0.463 ±0.056衰老模型組(SL) 10 2.505±0.3142) 0.752±0.0472)小劑量組(FCPS) 12 1.951±0.1752)4) 0.687±0.0632)3)大劑量組(FCPL) 12 1.653±0.1761)4)5) 0.532±0.0462)4)6)

圖1 各組大鼠腦NGF mRNA表達

3 討論

本研究結果說明衰老模型大鼠腦組織NGF mRNA水平較青年對照組降低，而AchE活性和LP水平增高，說明D-半乳糖可能通過誘導大鼠細胞代謝障礙或DNA損傷，導致自由基代謝紊亂，LP積累過多，后者可通過破壞磷脂膜結構，導致線粒體和粗面內質網減少以及空泡形成等亞細胞結構的變化，并使神經元數目減少。而神經元數量的減少進一步導致學習記憶功能的減退〔10〕。同時AchE活性的升高必然導致Ach降解加速，引起腦功能的減退。也有研究者發現，腦功能的減退與NGF受體脫失，膽堿能神經元對NGF攝入量減少有關。由靶區(海馬及新皮質)產生的NGF可經逆行運輸到中樞神經系統基底前腦膽堿能神經元胞體，發揮其靶源性營養作用。有研究提出膽堿能神經元亞群在學習和記憶中具有特殊功能〔3〕。而山茱萸多糖能抑制腦內LP的積累，從而使腦組織損傷終止并逐漸修復，提高老齡小鼠學習記憶功能。山茱萸多糖還通過上調NGF表達增加內源性NGF的含量，促進神經支配區的膽堿能纖維數量增加和單個軸突末梢形成較多的突觸，有助于神經元損傷后功能的迅速恢復。此外，山茱萸多糖還抑制AchE的活性，可通過減少Ach的分解、增加其合成和釋放這一過程而實現。

綜上所述，山茱萸多糖可抑制衰老模型大鼠腦脂質過氧化，上調NGF基因表達，提高AchE活性，進而改善衰老模型大鼠的腦功能，且山茱萸多糖大劑量的效果好于小劑量。

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