烏司他丁對內毒素血癥大鼠心肌TOLL樣受體4表達的影響

王葉舟 謝良地 韓 英 (福建醫科大學附屬第一醫院干部病房，福建 福州 350003)

內毒素(LPS)致心肌損傷主要是激活心肌Toll樣受體4(TLR4)，Foster等〔1〕發現 TLR4 能夠持續誘導 NF-κB 的活性，上調炎癥因子表達(如TNF-α、CRP、IL-6)。烏司他丁(UTI)是一種從人尿中分離純化的蛋白酶抑制劑，是一種分子量67 000 D的糖蛋白。UTI具有抑制多種蛋白、糖和脂類的水解酶的活性，抑制炎癥介質的過度釋放，有保護心肌的作用〔2〕。目前未有UTI對心肌TLR4表達影響的報道。本研究擬觀察UTI對內毒素血癥大鼠心肌TLR4表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠(8周齡)40只，體重(200±20)g，由中國科學院上海斯萊克實驗動物有限公司提供，所有動物都飼養在本研究所動物房，恒溫(22℃ ±2℃)、恒濕(55% ±5%)、人工光照明暗各12 h。24 h自由取食和飲水。飼料由上海必凱公司提供。

1.1.2 主要試劑及藥品 即用型S-P試劑盒、TLR4抗體、辣根過氧化物酶標記的山小鼠IgG、Western印跡化學發光試劑、抗βactin、免疫印跡化學發光試劑(Santa Cruz公司);RT-PCR試劑盒、Marker(Ferments公司);M-MLV反轉錄酶、ligo(dT)15(美國Promega);Taq酶(大連寶生物公司)，硝酸纖維素膜(Amersham公司);蛋白質分子量標準(中國科學院上海生物化學研究所);LPS(美國Sigma公司);DXM(浙江新昌制藥廠);UTI(廣東天普生化醫藥股份有限公司)，TNF-αELISA試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司);TLR4和內參B-actin引物設計、合成、測序由上海Invitrogen公司完成;其他常用試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 分組 SD大鼠隨機分為正常對照組，內毒素血癥組(LPS組)，LPS+烏司他丁組，LPS+地塞米松組，每組10只。

1.2.2 靜脈注射LPS致急性膿毒血癥動物模型建立 取SD大鼠給10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。除正常對照組外，其余三組暴露陰莖靜脈，給予脂多糖8 mg/kg大鼠陰莖靜脈注射，烏司他丁組與LPS+地塞米松組同時注射烏司他丁2.5萬U/kg、地塞米松5 mg/kg，正常對照組給予同量的生理鹽水;術后室溫3 h后取血及心肌后處死大鼠。HE染色觀察心肌病理改變。

1.2.3 檢測指標 ELISA法測血漿TNF-α，CRP含量。放免法測心肌組織中AngⅡ、IL-6水平。反轉錄－聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法測心肌組織TLR4 mRNA和TNF-α mRNA的表達。免疫組化法測心肌中的TLR4蛋白表達。蛋白免疫印跡法測心肌組織TLR4蛋白的表達。

2 結果

2.1 烏司他丁對LPS誘發SD大鼠血漿中TNF-α mRNA及蛋白表達的影響 與對照組相比，LPS組血漿TNF-α mRNA及蛋白水平明顯增高(P＜0.05);與LPS組相比，LPS烏司他丁組TNF-α mRNA及蛋白表達顯著降低，與LPS+地塞米松組無明顯差別。見表1。

2.2 烏司他丁對LPS誘發SD大鼠血漿CRP、IL-6、AngⅡ水平的影響 與正常對照組相比，LPS組血漿CRP、IL-6、AngⅡ水平明顯增高(P＜0.05);與LPS組相比，LPS+烏司他丁組CRP、IL-6、AngⅡ水平顯著降低，LPS+與地塞米松組無明顯差別。見表2。

2.3 烏司他丁對LPS誘發SD大鼠心肌TLR4 mRNA及蛋白表達的影響 與正常對照組相比，LPS組心肌TLR4 mRNA表達水平顯著增高(0.601±0.126 vs 0.089±0.011，P＜0.01);烏司他丁明顯抑制心肌TLR mRNA的表達，與LPS組相比，LPS+烏司他丁組心肌TRL4 mRNA表達水平明顯降低(0.393±0.115 vs 0.601±0.126，P ＜0.05);與 LPS+地塞米松組(0.147±0.042)相比也有明顯差異。

免疫組化法顯示，與正常對照組相比，LPS組心肌組織TLR4蛋白表達水平顯著增高(661.33±162.34 vs 156.81±16.25，P＜0.01);烏司他丁明顯抑制心肌中TLR4蛋白的表達，與LPS組相比，LPS+烏司他丁組心肌TLR4蛋白表達水平明顯降低(501.64±131.76 vs 661.33±162.34，P＜0.05)，與LPS+地塞米松組(401.77±110.75)比較也有明顯差異。蛋白免疫印跡法顯示，與正常對照組相比，LPS組心肌TLR4蛋白表達水平顯著增高(0.349±0.137 vs 0.083±0.019，P＜0.01);與LPS組相比，LPS+烏司他丁組心肌TLR4蛋白表達水平明顯降低(0.174±0.055 vs 0.349±0.137，P＜0.05)，LPS+地塞米松組TLR4蛋白表達水平為(0.106±0.016)。見圖1，圖2。

表1 烏司他丁對LPS誘發SD大鼠血漿中TNF-α mRNA及蛋白表達的影響(±s)

表1 烏司他丁對LPS誘發SD大鼠血漿中TNF-α mRNA及蛋白表達的影響(±s)

組別 TNF-α 蛋白 TNF-αmRNA正常對照組11.16±1.64 0.111±0.023 LPS組 20.64±2.611) 1.039±0.1781)LPS+烏司他丁組 15.67±2.212) 0.266±0.1082)LPS+地塞米松組 13.69±2.732) 0.217±0.0892)

表2 烏司他丁對LPS誘發SD大鼠血漿中CRP、IL-6、AngⅡ表達的影響(±s)

表2 烏司他丁對LPS誘發SD大鼠血漿中CRP、IL-6、AngⅡ表達的影響(±s)

組別 CRP IL-6 AngⅡ正常對照組1.71±0.41 80.36±15.76 338.34±67.18 LPS組 5.19±0.781) 265.08±39.861)1 093.88±227.031)LPS+烏司他丁組 4.17±0.562) 202.27±46.812)678.56±168.422)LPS+地塞米松組 3.32±0.962) 138.52±19.082)428.43±91.412)

圖1 TLR4蛋白Western印跡

圖2 心肌組織TLR4蛋白表達免疫組化

3 討論

TLR4是Toll樣受體家族的成員之一，能夠識別LPS〔3〕。內毒素血癥心肌TLR4表達是增加的〔4，5〕，LPS激活 TLR4介導的信號通路激活NF-κB，NF-κB進入胞核調控一系列炎癥介質的基因表達，TNF-α、IL-l等原發性炎癥介質增加，形成炎癥〔6〕。RAS與膿毒癥關系密切〔7〕，內毒素血癥時循環RAS被激活同時，組織內RAS系統即開始激活，陸國平等發現局部組織AngⅡ水平與臟器損傷程度相關〔8〕。UTI是一種蛋白酶抑制劑，具有很廣的抑酶譜和抑酶活性，能抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、巰基酶、纖溶酶等多種蛋白酶;UTI也是一種溶酶體膜穩定劑，能抑制溶酶體酶的釋放;此外，UTI還能抑制炎性介質的釋放，對心肌有保護作用。

本研究再次證實內毒素血癥時血中TNF-α、CRP、IL-6炎癥介質增加，心肌局部TNF-α表達增加和AngⅡ水平明顯增高，出現局部炎癥及心肌損傷。本試驗再次證實UTI在降低血中炎癥介質水平同時，降低TLR4 mRNA和蛋白的表達，減少心肌細胞TNF-α mRNA表達，并能降低心肌組織AngⅡ水平而保護心肌組織。

已有研究〔9〕顯示 UTI能減少 NF-κB 表達，從而降低TNF-α、CRP及IL-6等炎癥介質水平。本研究發現UTI不僅能降低TNF-α mRNA表達，還能降低TLR4 mRNA及TLR4蛋白表達。由于TLR4是內毒素導致組織細胞炎癥和損傷的始動環節，而UTI通過降低TLR4表達抑制LPS誘導的炎癥反應，但本研究未進一步明確UTI這種作用是直接還是間接的，需要進一步實驗證實。

1 Foster SL，Hargreaves DC，Medzhitov R，et al.Gene-specific control of inflammation by TLR-induced chromatin modifications〔J〕.Nature，2007;447(7147):972-8.

2 孫傳玉，邵 偉，畢嚴賓.不同劑量烏司他丁的心肌保護作用觀察〔J〕.山東醫藥，2005;45(24):71-2.

3 Gioannini TL，Weiss JP.Regulation of interactions of gramnegative bacterial endotoxins with manlmalian cells〔J〕.Immunol Res，2007;39(1/3):249-60.

4 張德明，李永旺，毛寶齡.內毒素血癥大鼠心肌TLR4與IL-18 mRNA表達的變化〔J〕.肺血管病雜志，2003;22(2):109-10.

5 尹海燕，韋建瑞，張 銳.膿毒癥大鼠心肌細胞Toll樣受體4和炎癥因子基因表達的變化及作用機制〔J〕.中國危重病急救醫學，2009;21(8):488-91.

6 沈 婷，白建文.Toll樣受體4與膿毒癥關系的研究進展〔J〕.上海交通大學學報(醫學版)，2011;2(2):243-6.

7 李晶鈴，陰赫宏，張淑文，等.局部腎素血管緊張素系統與膿毒癥〔J〕.中國危重病急救醫學，2004;16:639-40.

8 陸國平，鄔驚雷，陸鑄今.內毒素休克家兔心、肺組織局部血管緊張素系統變化〔J〕.小兒急救醫學，2005;12(5):389-91.

9 沈美華，霍正祿，梅 冰，等.烏司他丁對失血性休克復合內毒素模型兔肺組織中核因子-κB的影響〔J〕.中國急救醫學，2008;28(12)1102-6.