血紅素加氧酶-1基因轉染對內毒素誘導的ECV304細胞氧化損傷的影響

張培勝 邢邯英 野戰鷹 (河北省人民醫院老年醫學重點實驗室，河北 石家莊 05005)

血紅素加氧酶(HO)是血紅素降解起始酶和限速酶，HO-1為其誘導型。研究表明HO-1及其催化產物一氧化碳、膽紅素等均在抗氧化過程中發揮積極作用〔1，2〕。內毒素主要的致毒成分脂多糖(LPS)可以誘發多種炎性介質釋放和自由基生成增加，直接造成組織細胞的氧化損傷〔3，4〕。本研究借助逆轉錄病毒將HO-1基因轉染入人臍靜脈內皮細胞系ECV304，觀察HO-1基因表達上調對內毒素培養的ECV304細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 鋅原卟啉(zinc protoporphyrin，Znpp-Ⅸ)，LPS均購自美國Sigma公司。G418、DMEM培養基購自Gibco公司。乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物試劑公司。

1.2 細胞系及其培養 已轉染人HO-1(hHO-1)cDNA全長的雙噬性逆轉錄病毒包裝細胞系PA317/hHO-1(逆轉錄病毒載體重組體XM6/hHO-1經Lipofectin介導轉染入PA317細胞，同時帶有新霉素耐藥基因NeoR以用于選擇)〔5〕由首都醫科大學細胞生物系安威教授惠贈。PA317/hHO-1和小鼠成纖維細胞系NIH3T3細胞培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM中，ECV304細胞培養于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基(含D-葡萄糖5.5 mmol/L)中。

1.3 人血紅素加氧酶-1基因轉染ECV304細胞 PA317/hHO-1復蘇、傳代后收集病毒上清。以NIH3T3為靶細胞測定病毒滴度為4×105CFU/ml。此滴度的病毒上清可以完全勝任離體情況下的基因轉染，可以用于下一步實驗。2×105個ECV304細胞接種于25 cm2細胞培養瓶，24 h后加入1 ml病毒上清及終濃度為8 μg/ml的polybrene于37℃培養6 h，然后加入3 ml新鮮的培養液繼續培養48 h。細胞傳代并加入500 μg/ml G418(敏感劑量)，篩選14天后得到抗性克隆，繼續擴大培養得到轉染細胞，命名為ECV/hHO-1。選取生長良好且較為孤立的克隆，用胰蛋白酶消化后移到新的培養瓶中，擴增備用。ECV304轉染細胞經過 G418(500 μg/ml)連續2次篩選，ECV/hHO-1均能在含G418的培養液中生長，而對照細胞則全部死亡。

1.4 轉染細胞中血紅素加氧酶-1 mRNA和蛋白表達水平的檢測 Trizol一步法提取ECV304/hHO-1細胞和ECV304細胞總RNA。逆轉錄反應總體積為25 μl，包括RNA 10 μg。取逆轉錄反應液，分別進行hHO-1和內參照β-actin基因的PCR擴增。hHO-1的上、下游引物按照文獻〔5〕設計。擴增產物進行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進行圖像分析。

提取ECV304/hHO-1細胞和ECV304細胞總蛋白，蛋白定量后進行Western印跡檢測。取100 μg蛋白經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜。再分別與一抗(HO-1兔多克隆抗體按1∶1 500稀釋，GAPDH單抗為1∶2 500稀釋)和二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或兔抗鼠I gG抗體按1∶2 000稀釋)4℃過夜和室溫孵育2 h、DAB顯色、照相、圖像分析儀分析結果。

1.5 LDH釋放率測定 ECV304及ECV/hHO-1細胞以1×105個/ml接種于24孔板。無血清DMEM處理24 h后，細胞分為3組:① 未轉染ECV304組;② ECV304/hHO-1組;③Znpp-Ⅸ(20 μmol/L)+ECV304/hHO-1組。每組細胞分別用含或不含LPS(5 mg/L)的培養基培養24 h，收集培養上清液。每孔加入0.5 ml細胞裂解液(1%曲拉通X-100，150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris HCl，1 mmol/L EDTA)，振蕩 20 min，收集細胞裂解液，用比色法測定每孔(n=6)培養上清液和細胞裂解液中的LDH活性。以培養上清液中LDH活性單位占培養上清液加細胞裂解液中LDH總活性單位的百分比作為LDH釋放率。

1.6 MDA含量測定 細胞分組及處理因素同LDH釋放率測定。作用24 h后棄去上清，用PBS洗3次后每孔加入0.5 ml細胞裂解液，待細胞充分裂解后，參照MDA檢測試劑盒說明書測定MDA含量。細胞蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

1.7 統計學處理 采用SPSS11.0版統計分析軟件包處理實驗數據。數據采用±s表示，多組計量資料顯著性檢驗用單因素方差分析(ANOVA)和兩兩比較(LSD法)。

2 結果

2.1 血紅素加氧酶-1轉基因ECV304細胞的建立 RT PCR分析表明未被轉染的ECV304細胞hHO-1 mRNA表達量很低，而轉染hHO-1基因的ECV304表達量顯著升高(圖1)。Western印跡技術檢測ECV304細胞HO-1蛋白(32 kD)條帶較淺，而轉染細胞HO-1蛋白表達顯著增強，與ECV304細胞相比升高1.7倍，其IOD比值有顯著差異(圖2)。每種細胞GAPDH蛋白(36 kD)條帶表達水平相同，提示上樣量無差異。

2.2 LDH釋放率和細胞MDA含量 三組細胞在DMEM培養基中培養24 h后，LDH釋放率和細胞MDA含量相比均無統計學差異。在加用LPS(5 mg/L)培養24 h后，ECV304細胞LDH釋放率和MDA含量明顯增加 (P＜0.05);ECV304/hHO-1細胞組較ECV304細胞有所降低，兩者相比有顯著差異(P＜0.05)。在相同培養條件下加用Znpp-Ⅸ，ECV304/hHO-1細胞LDH釋放率和細胞MDA含量進一步上升 (P＜0.05)。見表1。

圖1 ECV304細胞和ECV304/hHO-1細胞HO-1 mRNA RT-PCR擴增圖片

圖2 ECV304細胞和ECV304/hHO-1細胞HO-1蛋白Western印跡分析

表1 各組細胞LDH釋放率和MDA含量的變化(± s，n=6)

表1 各組細胞LDH釋放率和MDA含量的變化(± s，n=6)

與同組內DMEM培養基比較:1)P＜0.05;與相同處理因素的ECV304組比較:2)P＜0.05;與相同處理因素的ECV304/hHO-1組比較:3)P＜0.05

組別 MDA含量(nmol/mg蛋白)DMEM培養基 DMEM培養基+LPS(5 mg/L)LDH釋放率(%)DMEM培養基 DMEM培養基+LPS(5 mg/L)ECV304組 0.62±0.11 1.54±0.071) 17.64±4.22 37.99±5.281)ECV304/hHO-1組 0.63±0.09 1.12±0.292) 15.82±4.81 22.10±3.772)ECV304/hHO-1+ZnPP-Ⅸ 組 0.64±0.12 1.95±0.223) 18.37±5.33 48.31±4.483)

3 討論

HO是參與血紅素降解的重要酶類之一，在微粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-細胞色素P450還原酶協同參與下形成一個短暫的電子傳遞鏈，其主要功能是分解血紅素的四吡咯環結構從而生成等摩爾的游離鐵、一氧化碳和膽綠素，而膽綠素在膽綠素還原酶的催化下迅速轉化為膽紅素。HO-1屬誘導型，正常情況下在大多數組織中表達量很低(只在脾、肝臟和睪丸中有較高表達)，但多種應激性因素可以誘導HO-1的表達和活性增強，如內毒素、高(低)氧、紫外線、重金屬和血紅素等〔6～8〕。大量研究證實上調HO-1的表達可以保護組織細胞、對抗氧化應激損傷。據此我們推測如果能夠人為地增加HO-1的表達水平將有助于提高ECV304細胞抗氧化損傷能力，發揮保護作用。本實驗中與LPS共培養的ECV304細胞MDA含量和LDH釋放率均增加，兩者變化相一致。LDH是能量代謝中的一種重要酶類，廣泛存在于各類組織細胞，其釋放率可用來衡量細胞受損程度，而MDA是氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化所形成的產物，其含量可以反映組織氧化損傷程度，這一結果提示氧化損傷在LPS致細胞損傷過程中發揮重要作用。ECV304細胞在轉染HO-1后，可以有效地降低氧化應激水平，而應用Znpp-Ⅸ可抑制HO-1活性，加重細胞的損傷。

逆轉錄病毒載體介導的基因轉染是基因治療的方法之一，雖然病毒滴度低于腺病毒載體，但對人體相對安全，不會造成全身性病毒感染的后果;而且能穩定地整合到宿主基因組，并將目的DNA傳遞給整個細胞群體，不會隨著細胞的分裂而丟失。本實驗借助逆轉錄病毒載體將外源性HO-1基因導入ECV304細胞，結果表明目的基因在轉染細胞表達量增高，而且傳代后維持高表達水平。應用逆轉錄病毒載體尤其是雙嗜性病毒時，生物學安全問題是不容忽視的。逆轉錄病毒雖能將目的基因有效的整合入宿主細胞基因組中，形成穩定的轉化細胞，但是這種整合是隨機的，目的基因表達的穩定性與插入的位點、方向及周圍基因等多種因素有關，同時基因的插入對目的細胞的其他生物學行為的影響也缺乏更多的證據。本實驗僅限于細胞水平上一個初步的、探索性的基因治療試驗，在整體情況下細胞可處于不同的分裂期，由于逆轉錄病毒只能感染分裂期細胞，而且易被體內補體所滅活，轉染效率很低。如何確保逆轉錄病毒使用的安全性和增強在體轉染的效率將會是今后工作的重點。

1 Wagener FA，Volk HD，Willis D，et al.Different faces of the heme-heme oxygenase system in inflammation〔J〕.Pharmacol Res，2003;55(3):551-71.

2 Cheng PY，Lee YM，Shih NL，et al.Heme oxygenase-1 contributes to the cytoprotection of alpha-lipoic acid via activation of p44/42 mitogen-activated protein kinase in vascular smooth muscle cells〔J〕.Free Radic Biol Med，2006;40(8):1313-22.

3 Matsuda N，Hattori Y，Zhang XH，et al.Contractions to histamine in pulmonary and mesenteric arteries from endotoxemic rabbits:modulation by vascular expressions of inducible nitric-oxide synthase and histamine H1-receptors〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2003;307(1):175-81.

4 李凝旭，李建軍，李庚山，等.細菌脂多糖誘導人外周血單核細胞腫瘤壞死因子α的合成及核因子-κB的活化〔J〕.中國動脈硬化雜志，2002;10(4):320-3.

5 張 敏，安 威，杜海軍，等.轉染人血紅素加氧酶-1基因對大鼠血管平滑肌細胞抗氧化損傷的作用〔J〕.生理學報，2002;54(1):12-6.

6 牟 嬌，何作云，王曉兵，等.血紅素氧合酶1-一氧化碳和一氧化氮合酶1-一氧化氮系統在動脈粥樣硬化中的作用及其相關性研究〔J〕.中國動脈硬化雜志，2005;13(4):403-5.

7 Zeynalov E，Shah ZA，Li RC，et al.Heme oxygenase 1 is associated with ischemic preconditioning-induced protection against brain ischemia〔J〕.Neurobiol Dis，2009;35(2):264-9.

8 Zheng Y，Liu Y，Ge J，et al.Resveratrol protects human lens epithelial cells against H2O2-induced oxidative stress by increasing catalase，SOD-1，and HO-1 expression〔J〕.Mol Vis，2010;16:1467-74.